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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 培养/筛选 » Red/ET大肠杆菌基因敲除卡那霉素筛选问题
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hihe99

银虫 (小有名气)

[求助] Red/ET大肠杆菌基因敲除卡那霉素筛选问题 已有4人参与

小弟刚开始做Red/ET系统的E. coli基因敲除，参考的是Jensen et al. Seven gene deletions in seven days: fast generation of Escherichia coli strains tolerant to acetate and osmotic stress. Sci Rep, 2015，这篇文章，技术原理基本跟试剂盒一致。

但是现在做的过程中，电击转化后15ug/ml卡那霉素筛选的假阳性率特别高，不知道各位虫友有没有相似的问题，求助这个可能是什么原因，应该怎么解决？

我自己现在大致做的一些东西摸索原因：
首先，原始菌株是确定没有抗性的；两端的同源臂各50bp，与基因组其他部分无同源性；
然后，我做了不加阿拉伯糖诱导的对照，结果对照平板上也有相似数目的克隆；
再后，用胶回收方法纯化敲除基因用的PCR产物（没有用Dpn I处理），纯化后的DNA同样做了诱导和不诱导的处理，这次不诱导的也有大量菌落，但比诱导的少些；
卡那霉素的平板应该是没有失效，因为用过不同批次的平板，正在验证是否失效。或者15ug/ml的浓度低了？但是这一步推荐的是这个浓度。

所以，这个抗性是怎么回事呢？感谢各位，就等着这个东西做实验材料了。
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1楼 2017-01-14 22:22:57
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同源臂是不是太少了点~增加同源臂能增加敲除效率，还有就是卡那霉素浓度太低了，可以提高到30
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···
2楼2017-01-16 08:45:41
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knogen

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

卡那霉素浓度我们一般都用30,50去做。
具体技术疑问可以联系我们咨询
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3楼2017-03-03 15:02:53
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heiye402

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
4楼2017-03-03 17:25:57
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刘成功

木虫 (著名写手)
好吧，你的太高大上

发自小木虫IOS客户端
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我辈只是蓬蒿人……
5楼2017-03-03 19:40:26
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)
我们经常做这个敲除的，具体操作可以咨询我

发自小木虫Android客户端
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6楼2017-03-03 21:13:15
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向日葵和梦缘

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by biosci at 2017-03-03 21:13:15
我们经常做这个敲除的，具体操作可以咨询我

怎么联系，谢谢
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7楼2017-05-05 15:14:01
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向日葵和梦缘

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也在做敲除，遇到和你差不多的问题，求交流
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8楼2017-05-05 15:15:40
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