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hihe99银虫 (小有名气)
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[求助]
Red/ET大肠杆菌基因敲除卡那霉素筛选问题 已有4人参与
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小弟刚开始做Red/ET系统的E. coli基因敲除，参考的是Jensen et al. Seven gene deletions in seven days: fast generation of Escherichia coli strains tolerant to acetate and osmotic stress. Sci Rep, 2015，这篇文章，技术原理基本跟试剂盒一致。 但是现在做的过程中，电击转化后15ug/ml卡那霉素筛选的假阳性率特别高，不知道各位虫友有没有相似的问题，求助这个可能是什么原因，应该怎么解决？ 我自己现在大致做的一些东西摸索原因： 首先，原始菌株是确定没有抗性的；两端的同源臂各50bp，与基因组其他部分无同源性； 然后，我做了不加阿拉伯糖诱导的对照，结果对照平板上也有相似数目的克隆； 再后，用胶回收方法纯化敲除基因用的PCR产物（没有用Dpn I处理），纯化后的DNA同样做了诱导和不诱导的处理，这次不诱导的也有大量菌落，但比诱导的少些； 卡那霉素的平板应该是没有失效，因为用过不同批次的平板，正在验证是否失效。或者15ug/ml的浓度低了？但是这一步推荐的是这个浓度。 所以，这个抗性是怎么回事呢？感谢各位，就等着这个东西做实验材料了。 |
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