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Nigori

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[交流] 表达谱基因芯片实验已有1人参与

实验方法原理

基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)，又称DNA微阵列(DNA Micorarray)，是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。在一定条件下，载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。

实验材料 组织或细胞样本

试剂、试剂盒：TRIzol、异丙醇、乙醇、氯仿、dNTPs、杂交试剂盒

仪器、耗材：电动玻璃匀浆机、电子天平、低温高速离心机、低温高速台式离心机、超净工作台、制冰机、电热恒温水槽、电泳槽、电泳仪、微波炉、凝胶成像仪、台式离心机、核酸定量分析仪、移液枪、可调电炉、旋涡混合器、杂交箱、杂交舱、Ｓ-200纯化柱、真空浓缩仪、盖玻片、芯片扫描仪

实验步骤

一、总RNA提取

1. 将超低温保存的样品除去样品袋，在电子天平上称重后，转移至用液氮预冷的碾钵中，用杵子碾磨组织，其间不断加入液氮，直至碾磨成粉末状。

2. 将碾磨成粉末状的样品，转移至已经加入适量TRIzol试剂的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中，在组织匀浆粉碎机上进行匀浆。匀浆至匀浆液不粘且无颗粒即可。

3. 将匀浆液转移至15 mL离心管中，于4℃，12 000 g，离心10 min。

4. 小心吸取上清液转入新的15 mL离心管，在15~30℃放置5 min。

5. 向匀浆液中加入氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，在15~30℃放置3 min。

6. 于4℃，12 000 g，离心15 min。

7. 从离心机中小心地取出离心管，吸取上清至另一15 mL离心管。

8. 向上清加入异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，在15~30℃放置10 min。

9. 于4℃，12 000 g，离心10 min。

10. 弃去上清，缓慢地沿管壁加入75%乙醇5 mL，轻轻颠倒洗涤离心管管壁，小心弃去乙醇。

11. 再加入75%乙醇10 mL，在涡旋器上短暂涡旋；于4℃，8 000 g离心10 min。

12. 小心弃上清，短暂离心，用移液枪吸去所有上清，在超净工作台中干燥沉淀5 min。

13. 加入RNase-free的Milli-Q水完全溶解RNA沉淀后，-80℃保存。

二、探针标记与杂交

1. 预杂交

（1）配制预杂交液：杂交试剂1加入到的Eppenderf管中，振荡混匀后，加入杂交试剂2混匀。

（2）将配制好的预杂交液放入95℃水浴锅内变性2 min，将待预杂交的玻片放入95℃水浴锅内变性30 s，玻片取出后即放入无水乙醇中30 s，晾干。

（3）将已变性的预杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42℃预杂交5～6 h。

2. 标记探针（以下在冰浴中进行）

（1）于一已灭菌的1.5 mL Eppendorf管内依次加入以下试剂(反应终体积为50 μL，以下试剂均为RNase－free)：

ddH2O 23 μL

逆转录引物 5 μL

总RNA 50~100 μg

振荡混匀，置于70℃水浴10 min。取出后，迅速置于冰上。

（2）分别加入以下试剂：

逆转录酶缓冲液 10 μL

DTT 5 μL

dNTPs 4 μL

（3）而后在暗室中加入以下试剂：

逆转录酶 2 μL

Cy5-dCTP或Cy3-dCTP 3 μL

（4）用手指弹打管壁以混匀样品，手浴2 min。将Eppendorf管置于42℃水浴2 h。

（5）依次在Eppendorf管中加入标记试剂I 4 μL，65℃水浴10 min后加入标记试剂II 4 μL。混匀，合并对照组、实验组。避光，真空抽干至50 μL左右。

（6）使用DNA纯化柱（或乙醇沉淀）纯化DNA。

（7）将柱体在旋涡混合器上剧烈振荡摇匀，悬浮内溶的树脂。将柱顶端的小帽旋松四分之一圈，掰断柱下端的密封头。

（8）将柱置于一个1.5 mL的Eppendorf管中，以3 000 rpm离心 1min将柱置于另一个新的1.5 mL Eppendorf管中，去掉顶端的帽，将样品慢慢加到树脂上表面的中间，注意不要搅动柱体。以3 000 rpm离心2 min，经纯化的样品流出，被收集在支持用的Eppendorf管中。

（9）加入标记试剂III 8 μL，真空抽干。

3、杂交

（1）在抽干的探针管中加6.5 μL杂交试剂I，充分混匀，使探针溶解。再加入6.5 μL杂交试剂II，混匀备用。

（2）将预杂交的玻片取出，用ddH2O冲去盖玻片。

（3）将探针置于95℃水浴中变性2 min；玻片置于95℃水浴中变性30 s，玻片取出浸无水乙醇30 s，探针取出后迅速置于冰上。

（4）将探针置于芯片上，用盖玻片覆盖，置于杂交舱中，用Parafilm密封，放入42℃杂交箱内杂交过夜(16～18 h)。

4、洗片

（1）用0.5%的洗涤液1冲洗玻片，去除盖玻片。

（2）准备两个染色缸，分别装有0.5%的洗片试剂1+2%的洗片试剂2、5%的洗片试剂3，放入60℃水浴锅中。

（3）将玻片依次浸入以上两个染色缸中洗涤10 min。

（4）用0.5%的洗涤液1冲洗玻片，晾干后扫描。

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