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Nigori

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mTOR信号通路已有1人参与

实验方法原理

通过特异性阻断PI3K和mTOR，观察HepG2和Hep3B细胞株PI3K/Akt/mTOR信号通路活性及生物学行为的改变，探讨相关的分子机制。

实验材料 HepG2人肝癌细胞、Hep3B人肝癌细胞株、人正常肝细胞株QSG-7701

试剂、试剂盒： LY294002、Rapamycin、阿霉素

仪器、耗材：流式细胞仪、荧光显微镜、二氧化碳细胞培养箱、酶标仪、培养板、盖玻片、载玻片

实验步骤

一、细胞株表达情况监测

1. 在培养的HepG2、Hep3B人肝癌细胞株和人正常肝细胞株QSG-7701上，以免疫印迹方法（Western blot）检测各细胞株中PI3K（p110α亚单位）、PTEN、pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表达情况。

2. 分别用 PI3K抑制剂LY294002（50μmol/ml）和mTOR抑制剂Rapamycin（RAPA，50 nmol/ml）孵育HepG2和Hep3B细胞，以MTT比色法检测细胞的增殖能力，以流式细胞术（Flow cytometry）检测细胞周期和凋亡情况，以Western blot法检测细胞中pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表达改变。

二、细胞株表达结果

1. PTEN在HepG2和Hep3B细胞中基本无表达，在QSG-7701细胞株中高表达，pAkt和p-mTOR在HepG2和Hep3B细胞中的表达较QSG-7701细胞均显著升高。

2. LY294002和RAPA均呈剂量-时间依赖的抑制HepG2和Hep3B细胞生长。饱和效应浓度的 LY294002和RAPA作用24小时后，HepG2和Hep3B细胞均呈现明显的G0/G1期阻滞，处于S期的细胞比例较对照组显著减少（P<0.01）。

3. 两给药组中HepG2细胞和Hep3B细胞的凋亡率与对照组比较均显著增加（P<0.01）。

4. 两给药组HepG2细胞的凋亡率显著高于Hep3B细胞（P<0.01或P<0.05），并且HepG2细胞的凋亡率在RAPA给药组显著高于LY294002给药组（P<0.01），但Hep3B细胞的凋亡率在两组间无显著差异。

5. 饱和效应浓度的LY294002作用48小时后，HepG2和Hep3B细胞中 pAkt（T308，S473）和p-mTOR（S2448）的表达水平较对照组均显著降低（P<0.01），饱和效应浓度的RAPA作用48小时后，HepG2和Hep3B细胞中P-mTOR（S2448）的表达水平较对照组均显著降低（P<0.01），而pAkt（T308，S473）的表达水平较对照组均显著升高（分别P<0.01）。

三、结果分析

1. HepG2和Hep3B细胞存在PI3K/Akt/mTOR信号通路的组成性激活。

2. LY294002和RAPA能有效阻断HepG2和 Hep3B细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路，抑制HCC细胞的生长增殖，诱导细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，且阻断效应与HCC细胞P53的表达有关。

3. 一定浓度范围内，HepG2细胞对PI3K/Akt/mTOR信号通路阻断剂的敏感性高于Hep3B细胞，RAPA对PI3K/Akt /mTOR信号通路的部分阻断效应优于LY294002。

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