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大鼠主动脉内皮细胞培养实验 已有1人参与
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大鼠血管内皮细胞培养可以： （1）用于血液流动性、防止血栓形成、调节血管张力等研究； （2）用于选择性通透性以及免疫调节等方面研究。 实验方法原理 贴块法适用于内皮细胞产量低的、管径较小血管的内皮细胞培养，其方法较酶消化法简便、经济。但缺点使易混有成纤维细胞和平滑肌细胞，前者的贴壁时间和内皮接近，后者贴壁较内皮慢，而且会被肝素所抑制。 实验材料 雄性Wistar大鼠 试剂、试剂盒：DMEM、胎牛血清、内皮细胞生长因子、肝素钠、青链霉素、明胶、胰蛋白酶、PBS、D-Hanks’液 仪器、耗材：手术器械、眼科剪、眼科镊、培养皿、手术刀、培养瓶、CO2培养箱 一、实验方法 1. 颈椎脱臼处死大鼠，将整个大鼠浸泡于75%乙醇中消毒约1 min。在无菌状态下，逐层剪开胸腔，分离取出主动脉，放含无菌 D-Hanks’液培养皿中。 2. 用眼科剪、镊尽量去除血管外膜的脂肪和纤维组织。然后，用含抗生素的D-Hanks’液冲洗血管的外表面及血管腔内的凝血数次，再放入另一无菌培养皿中。 3. 用眼科剪纵向剪开血管，平展在培养皿中。用非常锐利的手术刀将其切成1 mm3 大小的动脉植 块(或者用剪刀剪，依照个人习惯)，然后种植到培养瓶或培养皿(培养瓶或皿用1%明胶预置 37℃下过夜， 使用前2 h 移入CO2培养箱中。用时可以先经含 10%小牛血清的培养液冲洗)。将动脉植块的内膜面与瓶底接触，种植密度约为 1 块/cm2 。 4. 置培养箱中静置2 h(干贴壁)。然后，加入0.5 ml 含 25%胎牛血清的培养液，液量以略盖过动脉植块内膜面，而又不使植块漂浮为宜。24 h 后，更换培养液，加入 2-3 ml 培养液。 5. 72 h 左右的时候，当观察到内皮细胞充分长出，而成纤维细胞刚要长出的时候，将动脉植块除去，刮除成纤维细胞，换培养液1 次。以后每2 天换液一次，每次换1/2~1/3 的液量。继续培养 8-10 d， 细胞融合成单层，即可传代。 二、实验结果 植块培养法进行的原代培养，一般在培养2-3 天，动脉植块周围即有细胞生长，并渐向外延伸，呈扁平短梭形或多角形；约8-10 d 后细胞融合成片。采用vWF 免疫组化鉴定，主要表达在细胞浆中。 |
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