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碱裂解法抽提质粒DNA 已有2人参与
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[实验原理] 质粒是存在于染色体外的小型双链环状DNA，大小在1-200kb之间，能在宿主菌中自主复制。宿主细胞中质粒的拷贝数各有不同，一种是低拷贝数的，每个细胞仅含有一个或几个质粒分子，称为“严紧型”复制的质粒，另一类高拷贝的质粒，拷贝数可达到20个以上，这种类型称为“松弛型”复制的质粒。 质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（氨苄青霉素、四环素等抗性），利用这些抗性可以对宿主菌或重组菌进行筛选。 质粒作为基因工程载体必须具备以下条件（1）复制子（ori）：一段具有特殊结构的DNA序列；（2）有一个或多个便于检测的遗传表型，如抗药性、显色表型反应等；（3）有一个或几个限制性内切酶位点，便于外源基因片段的插入；（4）适当的拷贝数。制备质粒载体是分子生物学的常规技术。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 [实验目的] 1、掌握碱裂解法抽提质粒DNA的原理和方法。 2、掌握紫外吸收光谱法测定核酸含量的原理和方法。 [实验步骤] 1、试剂配制 （1）LB培养液 10 g Tryptone，5 g Yeast Extract，10 g NaCl，双蒸水定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。 （2）LB平板培养基 在LB液体培养基中加入琼脂粉15g，高压灭菌，冷却至45℃左右时倒平皿，4℃保存。 （3）LA平板培养基 待LB液体培养基冷却至45℃左右加入Amp (100μg/mL)，摇匀后倒平皿，4℃保存。 （4）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),10 mmol/L EDTA (pH8.0), 配制200ml。 取葡萄糖（C6H12O6.H2O）1.982 g，双蒸去离子水160 ml，0.5 mol/L EDTA 4ml，1 mol/L Tris-HCl(pH8.0) 5 ml，定容至200 ml，高压灭菌后4℃保存。 （5）溶液II：0.2 mol/L NaOH, 1%SDS。 配制100 ml，现用现配。 10 mol/L NaOH 2 ml，双蒸去离子水80 ml，10%SDS 10 ml，最后用双蒸去离子水定容至100 ml，室温保存。 （6）溶液III：配制100 ml。5 mol/L 乙酸钾 60 ml，冰乙酸11.5 ml，双蒸去离子水28.5 ml。 （7）5 mol/L 乙酸钾（200 ml），乙酸钾98.14 g，溶解于160 ml双蒸去离子水中，搅拌溶解后定容至200 ml。 （8）3 mol/L 乙酸钠（NaAc）（pH5.2)，取乙酸钠（CH3COONa.3H2O) 204.1g，溶解于200 ml双蒸去离子水中，用冰乙酸调pH5.2，双蒸去离子水定容至500 ml，高压灭菌后4℃保存。 （9）10 mol/L NaOH溶液（100 ml），NaOH晶体40 g，加水至100 ml。 （10）10%SDS， 称取SDS 10g，溶解于80 ml水中，68℃助溶，加数滴1 mol/L HCl调pH7.2,定容至100 ml。 （11）0.5 mol/L EDTA（pH8.0) （100 ml）。Na2EDTA.2H2O 18.61 g, H2O 70 ml，边搅拌边加入NaOH固体调节pH，接近pH8.0时才充分溶解，大约需NaOH 2g。最后加水至100 ml。 （12）TE缓冲液（pH8.0） （100 ml），10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。 2、细菌的培养 （1）配制LB液体，在琼脂糖平板培养基上划线培养出单菌落（37℃，16-20小时）。 （2）在灭菌过的10 ml玻璃培养管中加入3 ml LA液体培养基、以及3微升Amp (100 ug/ml)，挑取单菌落至培养基中。将培养管置于摇床中，３７℃振摇过夜(200-250 rpm,16-18小时)。 3、质粒的提取 （1）吸取1.5毫升菌液至1.5 ml Eppendorf离心管中，3 000 rpm离心3分钟，弃上清液。 （2）加上1.5毫升菌液，重复操作（１）。 （3）用移液器尽可能除去上清液，加入150微升溶液Ｉ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。 （4）加入250微升溶液Ⅱ,缓慢地上下翻转离心管约10次，混合均匀。室温下放置５分钟。 （5）加入200微升溶液Ⅲ，上下翻转离心管约10次，混合均匀，冰浴10分钟。４℃，14,000 rpm离心5分钟。 （6）用移液器将上清液转移到新的1.5 ml Eppendorf离心管中，加入１倍体积酚／氯仿抽提，14 000 rpm离心５分钟。 （7）重复步骤（6）1次。 （8）移取上清液（400－500微升），加入2倍体积无水乙醇、0.1倍体积3 mol/L醋酸钠，置于－20℃冰箱30分钟。 （9）14 000 rpm 离心10分钟，尽量去掉酒精。 （10）用0.5 ml 70％酒精洗DNA沉淀１次，离心２分钟，尽量去掉酒精，风干１０分钟。 （11）加50微升TE缓冲液溶解DNA沉淀，然后加入１微升RNase，37℃过夜，－20℃保存。 4、DNA浓度测定 （1）标准曲线的制作 分别用蒸馏水将DNA标准品配制成浓度为5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg/mL的DNA溶液，于260 nm处测定光吸收值，在电脑中用软件制作标准曲线。 （2）样品测定 取20微升质粒DNA置一干净的离心管中，加入2 980微升蒸馏水稀释。然后用紫外分光光度计测定260nm和280nm的光吸收值。计算DNA浓度，并通过OD260/OD280比值评估样品纯度。 |
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