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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 绝对定量PCR具体步骤求助！
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ljf0814

铜虫 (初入文坛)

[求助] 绝对定量PCR具体步骤求助！ 已有2人参与

本人定量新手。现在已经用带有目的序列的质粒做好了标准曲线，准备测处理过的样品里的相应基因的表达量。请问我提取总RNA之后该用多少RNA反转录cDNA，反转录好后该怎么处理cDNA，该定量体系里该加多少cDNA做模板？我做标准曲线时用的是20ul体系。恳请大家帮忙，越详细越好，谢谢啦！
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1楼 2017-01-02 21:42:55
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peitaokong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般情况RNA质量提取还不错的话，10μL反转体系可以加1000ng的RNA，20μL反转体系可以加2000ng的RNA。20μL的上机实验加1μL的cDNA就足够了。具体的反转录母液，如果RNA质量没有问题稀释个4到5倍做基因表达都还是效果不错的。你可以根据你所做基因的多少选择稀释倍数以及反转录体系。比如说你做4个基因，你可以选择10μL体系反转录，加入20μL的水，相当于稀释了3倍这样的模板也是够用的。
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2楼2017-01-03 10:02:13
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star013

新虫 (知名作家)
我们公司可以做荧光定量技术服务

发自小木虫Android客户端
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3楼2017-01-03 10:09:39
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ljf0814

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by peitaokong at 2017-01-03 10:02:13
一般情况RNA质量提取还不错的话，10μL反转体系可以加1000ng的RNA，20μL反转体系可以加2000ng的RNA。20μL的上机实验加1μL的cDNA就足够了。具体的反转录母液，如果RNA质量没有问题稀释个4到5倍做基因表达都还是效 ...

那反转录的cDNA还需要测OD值吗？我怎么确定反转录母液该稀释多少倍呢？
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4楼2017-01-03 20:03:45
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你是路人甲

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

需要加多少cDNA做模板这个你可以看说明书，说明书里这些信息都有

2xBIOGHC Elitefast SYBR Mix  10μl
BIOGHC Elitefast Enzyme Mix  1μl
上下游引物 (10μM)       各0.4μl
模板RNA                10ng-1μg
RNase free ddH2O         加至20μl
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5楼2019-12-16 17:03:24
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