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基因敲除过程中的质粒验证问题。
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本人最近在做一株蜡样芽胞杆菌敲除，使用温敏型质粒，带有氯霉素抗性。电转化。 基本情况是这样的： 1 已经反复确认了原生菌没有氯霉素抗性，转化后的菌株可以在氯霉素的液体中稳定传代。转化后菌株菌落形态与原生菌一致，16s鉴定完全一致，基本排除是杂菌的可能性。 2 菌液pcr正确。使用了构建同源臂时的引物，得到正确条带。 疑点：一直都提不出质粒，试过好多次。试过单独溶菌酶（溶于溶菌酶缓冲液）先处理后再提质粒的试剂盒，也试过直接将溶菌酶溶于solution1 后37℃水浴30分钟。溶菌酶浓度试过2mg/ml-25mg/ml不等。 每次提出质粒测浓度有100-200ng/ul，纯度良好 260/230在1.8左右，260/280在2.0左右。 但是每次跑电泳及单双酶切均得不到条带或者得到多条不正确杂带。但是我构建好的重组质粒为阳性对照一起点样时正确的。所以电泳及酶应该没有问题；而且溶菌酶应该也没有问题，最近用它提取阳性菌的基因组得到的基因组浓度很高。 附件附上两次跑质粒以及单双酶切的结果。提取了三个菌落加入氯霉素扩大培养后的质粒，培养时间12-13小时。 左侧是跑质粒，右侧是单双酶切，左侧从左到右分别是三个样品的质粒，环形marker，原生质粒（有一幅图没有这个对照），重组质粒阳性对照。 右侧是每个样品的单酶切，单酶切，双酶切，marker，还有原生质粒与 重组质粒的单双酶切。 写的很多很乱，但是很希望有高手个解答一下，转化好多次结果都是这样，快一年了  金币不多，已经是全部了 急求高手~~~~~不胜感激 161223重组菌提质粒单双酶切及 pksv7-ud酶切1.jpg  161222重组菌提质粒单双酶切及 pksv7，pksv7-ud酶切.jpg |
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