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丽姐萍妹

新虫 (正式写手)

[求助] 双酶切

我用的是xba1和kpn1双酶切的 买的neb的酶 50ul体系 酶的量都是1ul 共用的cutsmart 5ul 67度两小时和过夜我都做过了 都没切开 好像只是单酶切了 我也分别检验了两个酶 分别做了单酶切 没有问题 我想问题出在哪里？我用的载体质粒 之前毕业的师姐有做成功过的 我知道xba1有甲基化 可是是因为这个吗？不知道问题出在哪里？不会啊 菜鸟 求指导 最近在构载体 双酶切就出现问题了 郁闷

@wizardfan @biostar2009 发自小木虫Android客户端
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1楼 2016-12-29 18:57:12
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chenjunpku

新虫 (初入文坛)
既然单酶切没问题，就分两次酶切。每次都用最适buffer，酶切后过个PCR产物回收柱，再第二个酶切。还有，大部分内切酶的反应温度是37度

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2楼2017-01-02 00:22:13
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水清泉

金虫 (著名写手)
你要看酶的特性，快酶一般是37度，30分钟足矣。慢酶有的有有不同的温度，可能需要俩小时呢。

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别人能做的事情我要努力做得更好！
3楼2017-01-02 01:44:47
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lining0624

新虫 (初入文坛)
67度？Thermo的快切酶？我们都是用65度失活

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4楼2017-01-02 09:50:06
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丽姐萍妹

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenjunpku at 2017-01-02 00:22:13
既然单酶切没问题，就分两次酶切。每次都用最适buffer，酶切后过个PCR产物回收柱，再第二个酶切。还有，大部分内切酶的反应温度是37度

是的 我用的都是37度 两个都是neb酶的酶 都是cutsmart 分部酶切的话 第一步的酶需要失活吗？没做过这块 不太懂呢

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5楼2017-01-02 12:36:47
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丽姐萍妹

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 水清泉 at 2017-01-02 01:44:47
你要看酶的特性，快酶一般是37度，30分钟足矣。慢酶有的有有不同的温度，可能需要俩小时呢。

我是是满足快酶的特性 不过我仍然切了两个小时 还是没多大变化 不知道是不是体系出问题了

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6楼2017-01-02 12:37:38
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丽姐萍妹

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lining0624 at 2017-01-02 09:50:06
67度？Thermo的快切酶？我们都是用65度失活

我不懂分布酶切 因为我买的是neb的酶 有共用的cutsmart 所以我直接双酶切的 现在没做出来 我不知道要不要分开进行

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7楼2017-01-02 12:39:20
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xinxinjin

银虫 (知名作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 丽姐萍妹 at 2017-01-02 12:39:20
我不懂分布酶切 因为我买的是neb的酶 有共用的cutsmart 所以我直接双酶切的 现在没做出来 我不知道要不要分开进行
...

现在我买的NEB 的酶，Kpn I 的buffer是1.1，Xba I的buffer是Cutsmart啊
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8楼2019-05-08 16:32:24
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