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专业蛋白质westernblot检测的详细方法 已有1人参与
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WESTERN BLOT ①将蛋白电泳后的凝胶浸入电转缓冲液中15min。 ②将电转膜（醋酸纤维素膜）先在甲醇中浸泡至完全湿润（甲醇用于活化电转膜上的基团，可能是使得膜上的正电性增强），然后再将膜浸入超纯水中5min，最后再将膜浸入电转液中15min。 ③滤纸先在电转液中完全浸湿，然后将滤纸平铺在电转纤维上，在滤纸正上方平铺凝胶，在凝胶正上方平铺电转膜，在电转膜正上方平铺滤纸，最后用玻棒赶气泡。（注：滤纸一定要比电转膜略小，也可比凝胶略小，最好与凝胶大小一致；电转膜应与凝胶大小一致或略大；理论上，电转膜的大小只要能够覆盖住目标区域即可）。 ④100V，电转100min。（注：电转仪置于冰浴中，并且电转仪中还要放入搅拌子；注意电转时的正负极，黑色朝向黑色）。 ⑤电转结束后，将电转膜浸泡于甲醇中5min，最后将电转膜浸泡于4ml 10%的牛奶（2g奶粉溶于20ml超纯水）中（5%BSA），置于37℃摇床（75rpm）封闭1.5h（也可4℃封闭过夜）。 （注1：若采用预览的Marker可以在转膜结束后看到Marker条带是否转移到膜上，据此判断蛋白条带是否转移到膜上，因此可省略丽春红浸泡观察等过程，直接封闭。 注2：不论是封闭还是后面的加一抗和二抗，都要将自封袋中的气泡赶走，尤其是大气泡，因为大气泡的存在阻隔了牛奶、一抗和二抗与膜的接触，不利一抗与二抗的接触，导致后面显色不明显；摇床转速不能太快，否则会一抗与二抗即使结合了又会被甩分开）。 ⑥封闭1.5h结束后，电转膜用PBST溶液（1L 1×PBS溶液+500ulTween-20，注意Tween粘度较大，吸取时要慢，否则吸不够量；同样地，打出时也要慢，否则会没有全部打出）洗3次，每次10min。 ⑦将电转膜浸入一抗溶液中，置于37℃摇床，75rpm，1.5h（一抗溶液的制备：10ml的10%脱脂牛奶或BSA溶于PBST中+5-10ul一抗，即共稀释了1000-2000倍，可根据需要自行设计抗体稀释倍数）。 ⑧一抗溶液浸泡结束后，将电转膜用PBST溶液洗3次，每次10min。 ⑨将电转膜浸入二抗溶液中，置于37℃摇床，75rpm，1h（二抗溶液的制备同一抗）。 ⑩二抗溶液浸泡结束后，将电转膜用PBST溶液洗3次，每次10min。洗完后，将膜浸泡于底物溶液中显色，显色结束后，用滤纸吸干膜上的水分，将膜置于凝胶成像仪中用白光拍照。电转膜用保鲜膜包裹保存（有时显色时间过长，导致背景颜色较深，则拍照时可将电转膜反过来拍背面）。 注：凝胶和电转膜都要用剪刀剪去一角用以定位。 |
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2楼2017-03-23 14:49:10
