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兴奋剂促红细胞生成素免疫检测方法的研究 已有1人参与
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1.抗人促红细胞生成素单克隆抗体的制备复苏抗rHuFPO杂交瘤细胞，采用动物体内诱生单克隆抗体的方法，大量制备腹水。用快速蛋白液相分析仪(FPLC)，联合使用疏水柱(Phenyl-SepharoseCL-4B)和ProteinASuperoseFastFlow柱纯化单克隆抗体。 2.单克隆抗体理化性质及亲和力的鉴定采用双向免疫扩散法、紫外分光光度计法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分别测定单克隆抗体的免疫球蛋白类别及亚类、浓度和分子量。参照Beatty等人所建立的方法，寻求抗体与固定化抗原亲和常数。确定抗体的工作浓度，并以此浓度，按照Friguet的方法选择最合适的抗原包被量。作OD450nm与对数抗原稀释度的关系曲线，求得液相亲和常数。 3. 藻胆蛋白的制备、纯化及性质测定培养钝顶螺旋藻，收集的鲜藻泥通过硫酸铵分级分离法得到藻胆蛋白的粗品。联合使用DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱和SephacrylS-200HR柱进一步纯化藻胆蛋白，得到的纯品进行分子量测定，并测定藻胆蛋白的激发和发射光谱。 4.单克隆抗体-藻胆蛋白荧光探针的制备5 mg PBP和5 μg SPDP依洪孝庄等人的方法进行偶联，制备单抗-藻胆蛋白的偶联物。 5.竞争酶联免疫吸附试验检测方法检测血清EPO的含量以测定抗体与溶液中抗原的亲和常数时所用抗体浓度作为抗体的工作浓度，并以其所用抗原包被量包被酶标板。将含一定量rHuEPO的标准溶液按倍比稀释与定量McAb溶液分别混合，室温下温育15 min后加入以rHuEPO包被的酶标板中，以EPO稀释倍数的对数(以2为底)为横坐标，OD450nm为纵坐标绘制标准曲线。将正常人血清100 μ1与建立标准曲线时同样量McAb混合，室温下温育15 min后加入与建立标准曲线时同样量rHuEPO包被的酶标板中，同上操作，所测数据即为血清中EPO含量的OD值，按照标准曲线可以得到血清中的EPO含量。 6.荧光免疫法检测血清中EPO的含量用McAb包被酶标板，4℃冰箱过夜后0.01MPBS-T洗3次，每孔加入对应浓度为10-12～10-10 mol/L之间的一系列标准EPO溶液，与过量IgG-PBP探针的混合物(此混合物已在4℃过夜)37℃下保温1 h，酶标板用PBS-T洗涤(3×3 min)，加入荧光洗脱液100 μl/孔，50℃下温育30 min。同一样品做5孔。收集相同5孔内的液体，HITACHIF-4500荧光分光光度计测荧光最大发射峰值对应的荧光强度，画出标准曲线。用McAb包被，4℃冰箱过夜后0.01MPBS-T洗3次，每孔加入50 μl正常人血清样品与过量IgG-PBP探针的混合物(此混合物已在4℃过夜)，以下操作同上，荧光分光光度计测荧光最大发射峰值对应的荧光强度后，按照标准曲线可以得到血清中的EPO含量。 |
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