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玻璃化冻存技术成功解决活肿瘤组织冻存复苏难题 已有1人参与
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我们研发的玻璃化冻存技术成功突破了活肿瘤组织冻存复苏后存活率低的难题，使得冻存的肿瘤细胞可长期保存肿瘤组织活性，组织复苏后可维持与新鲜肿瘤组织几乎相同的形态特征和功能。 1、活肿瘤组织样本库的意义 活体组织特别是活肿瘤组织，具有重要的科研和临床应用价值，活组织保存技术是实现这些价值的基础。 常用的活肿瘤组织保存方法主要为建立PDX肿瘤模型保存和冻存。建立PDX肿瘤模型保存，耗时耗力，程序繁琐，费用昂贵，且经过多次传代后，肿瘤组织容易发生变异，肿瘤组织异质性丧失，失去保存的价值。 活肿瘤组织冻存即将组织置于低温环境中保存，以使组织暂时脱离生长状态，保存肿瘤组织的特性。这样的保存方式省心省力，操作简便，且成本低廉。在需要的时候才将组织复苏移植，使之以原代肿瘤形态增殖，很好地保存了肿瘤的原始突变，可获得分子、细胞、组织及体内等多水平的全面的肿瘤信息数据。 2、现有活肿瘤组织冻存技术——肿瘤组织冻存复苏后存活率低 以往的新鲜的活肿瘤组织采用的冻存方式与细胞冻存类似，一般为程序降温冻存，组织冻存液一般由DMSO、血清、细胞培养液组成，需要现用现配。但是由于血清的成分不定，冻存液的稳定性差，使得这种组织冻存液的保质期较短，保存条件也较为苛刻。 使用现有的组织冻存液冻存肿瘤组织时，只有极少数的肿瘤组织可以复苏或以肿瘤细胞的形式进行传代，更无法以原代肿瘤的形态增殖，且极易丢失肿瘤的原始突变，只能获得分子水平的数据信息。故而，现有的组织冻存液的应用范围狭窄，降低了肿瘤组织样本的应用价值和科研转化能力。 3、玻璃化冻存技术——长期保存肿瘤组织活性 最近，我们采用玻璃化技术成功突破了活肿瘤组织冻存复苏难题，应用该技术冻存的肿瘤组织可长期保存肿瘤组织活性，组织复苏后可维持与新鲜肿瘤组织几乎相同的形态特征和功能，该技术的具体特点是： 1)、冻存后可长期保存（>10年）。 2)、复苏后形态功能与新鲜组织一致。 3)、复苏后仍可分离原代肿瘤细胞。 4)、冻存前后PDX成瘤能力基本不变。 5)、可替代冰冻切片和石蜡固定组织。 6)、实现DNA、RNA和蛋白活性保存。 7)、手术标本、活检组织均适用。 4、活肿瘤组织样本库的应用 1)、肿瘤精准治疗的临床前评价 近两年来，肿瘤精准治疗理念已深入人心，免疫治疗和靶向药物取得一定突破，但目前手术和放化疗仍然是主要治疗方式，其中肿瘤化疗已成为常规治疗手段。然而，由于肿瘤异质性极大，同一种化疗方案在不同病人间的治疗反应可能迥异，因此如何评价和选择合适的化疗方案，一直是困扰临床医生和病人的主要矛盾。 虽然前期研究人员采用原代肿瘤细胞或组织球在评价肿瘤药物中取得了一定进展，但这两种方法均需要对肿瘤组织进行细胞分离，一方面体积较小的肿瘤无法获得足够的细胞进行研究，另一方面由于分离的肿瘤细胞脱离了肿瘤组织微环境，其测试的结果也往往不能真实反映肿瘤对药物的敏感性。因此，近几年在国外对肿瘤组织薄层切片培养的研究日益受到关注。研究标明，0.2-0.3毫米的薄层肿瘤组织切片可充分保证其在培养基中对营养的吸收和物质交换。在优化的培养基和特殊的支持物上，肿瘤组织切片可存活7天以上，完全可满足体外药物筛查的要求。与原代肿瘤细胞或组织球相比，薄层肿瘤组织切片需要的组织体积较小，且保留了完整的肿瘤组织结构，通过体外培养结合化疗药物处理，可真实高效的反映肿瘤对药物的敏感性。我们的前期研究标明，冻存复苏的肿瘤组织可保留新鲜组织70-80%的活性，经体外肿瘤组织薄层切片培养测试，与新鲜肿瘤组织切片具有完全相同的药物反应性，可为肿瘤复发和转移患者提供实时的肿瘤药物敏感性测试。 此外，冻存复苏的活肿瘤组织还可用于建立PDX模型（人源性肿瘤动物模型），由于高度模拟患者肿瘤的生物特征，PDX模型被认为是最好的肿瘤研究和治疗评价模型，用于药物研发、测试和生物标志物鉴定。理想的活肿瘤组织应当直接来源于患者，由于PDX模型鼠的建立操作程序复杂繁琐、运行成本高昂，因此只有少量患者肿瘤组织能被利用。而使用活肿瘤组织冻存技术，可实现肿瘤组织的即时冻存和随时复苏，与PDX模型结合，可为肿瘤治疗的临床前评价提供体内评价模型。因此，活肿瘤组织冻存为肿瘤组织薄层切片培养和PDX模型建立提供了可能，也为肿瘤精准治疗提供了全新的思路。 2)、肿瘤研究的珍贵资源和有效工具 以往的肿瘤组织样本库保存的都是“死”的肿瘤组织，如速冻组织和组织蜡块等，仅能提供DNA、RNA和蛋白等“静态”信息，肿瘤一旦冻存即无法“复活”，无法获得肿瘤的“动态”信息。由于肿瘤存在极大异质性，且肿瘤组织一直处于进化过程中，静态和固定化信息不能真实反映肿瘤的变化规律。另一方面，随着肿瘤研究的快速发展，新的治疗药物和手段层出不穷，急需“活“的肿瘤组织进行研究和测试，因此活肿瘤组织冻存和复苏技术的突破，为肿瘤研究提供了全新的资源和手段。  活肿瘤.jpg  活肿瘤2.jpg  活肿瘤3.jpg  活肿瘤4.jpg  活肿瘤5.jpg  活肿瘤6.jpg |
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LiveTissue 活肿瘤组织冻存技术常见问题解答 1. 可以冻存什么样大小的肿瘤组织？ 可以冻存肿瘤患者的手术组织和穿刺组织，也可以保存PDX鼠的传代肿瘤组织。 2. 新鲜的肿瘤组织怎样保存和运输？ 应浸于专用的组织运输液或完全培养基内，0~4℃低温保存，于2小时内低温运输到实验室立即冻存处理。鉴于手术组织容易酸化腐烂，普通的组织运输液和完全培养基不能长期保存肿瘤组织，所以我们在开发能长期保存（~7天）组织的运输液，届时我们将通过微信公众号发布该产品。 3. 冻存处理前组织标本要注意什么？ 获得肿瘤病人的知情同意；保存好原始完整病历档案；确认无HBV、HCV、HIV等病毒感染，防止处理过程中造成标本间交叉污染，确保实验人员的安全防护。 4. 冻存肿瘤组织需要多久操作时间？ 做一批实验，1~4份穿刺的肿瘤组织需要30分钟左右，1~3份手术组织需要60~90分钟左右。 5. 组织冻存和复苏的操作注意事项和关键步骤有哪些？ 成功的冻存和复苏必须注意快速降温和快速升温。即，组织移入、移出液氮时，要在液氮上操作，并且速度要快。 6. 组织切片模具和刀片能重复使用吗？怎样消毒？ 组织切片模具可以重复使用，可以用75%酒精浸泡并晾干后使用，也可以浸泡后高压灭菌再使用。刀片为无菌分装一次性使用。 7. 有些肿瘤组织非常有弹性，不容易切片怎么办？ 按照我们的教学视频，通常需要2个刀片固定肿瘤组织。如果由于组织弹性太大而不容易固定，可以用3个刀片固定，或者将组织切割成更小体积，再用刀片固定。 8. 细胞冻存通常要求冰上操作，为什么肿瘤组织冻存说明书上要求26℃处理？这样会对组织造成损伤吗？ 任何冻存方法对细胞或者肿瘤组织都会造成不同程度的损伤。组织冻存不仅要冷冻保存多层细胞，还要保存细胞间质，选择合适的冷冻时间和温度很重要。如果温度太低，渗透速度太慢需要更长的处理时间，温度太高则冷冻保护剂有一定毒性。我们选择26℃是因为在这个温度下，冻存液中的冷冻保护剂在相对短的时间内能够快速渗透到细胞和细胞间质中。 9. 组织冻存是把组织浸在冻存液V1、V2后直接存放液氮罐吗？ 不是。本试剂盒的方法是将组织切成均匀的薄片，再使用冻存液梯度处理组织薄片使冷冻保护剂渗透至组织内，多余的冷冻液需要弃去。冻存的是组织，不包含大量的冻存液。 10. 液氮处理后，组织会从金属的组织支架上掉下来吗？ 不会，组织会固定在支架上。 11. 组织支架上为什么有很多小孔？ 为了快速热传导，玻璃化冻存需要急剧降温。 12. 可以先把组织及组织支架放入冻存管后，再把冻存管放入液氮中急剧降温处理吗？ 不可以，冻存管的热传导效率差，不能达到玻璃化冷冻要求的急剧降温速度。 13. 为什么组织支架要在液氮中浸润5分钟以上？ 为了使肿瘤组织降温充分和均匀。 14. 液氮冷冻处理后的组织能放到-80℃冰箱后，再转入液氮罐吗？ 不能。液氮冷冻处理后的组织<-135℃是玻璃化冷冻状态，如果放到超低温冰箱，造成温度上升，组织细胞内会形成冰晶，造成组织坏死，不能继续使用。 15. 组织复苏时为什么要摇一摇？ 成功的复苏也应当遵循快速升温的原则，摇一摇有利于冻存组织快速、均匀地升温。摇动后，组织也会从支架上脱落。 16. 复苏时每次都要更换一个培养皿吗？ 操作人员务必确保不同病例的组织不能混用培养皿。单个病例的标本可使用一个培养皿，只需将培养皿中的液体弃净。 |
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