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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物酶切连接pET 28a，测序发现引物部分碱基缺一个C
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Ivy尘

新虫 (正式写手)

[交流] PCR产物酶切连接pET 28a，测序发现引物部分碱基缺一个C

最近实验一直不顺利，各种突变和缺失，累觉不爱。

上游引物加了保护碱基和Ndel/Xbal酶切位点，引物开头是5’-tctagaCATATGGCCAG.........

测序回来，峰图很干净，完全没有套峰。
PCR产物酶切连接pET 28a，测序发现引物部分碱基缺一个C
突变的碱基就不管了，但是开头CATATGGCAG， 少了个C！！！后面都乱码了，跪。。。。。
PCR产物酶切连接pET 28a，测序发现引物部分碱基缺一个C-1

问了生工测序，也回答说测序没问题。

我觉得也不该是KOD酶的问题吧，毕竟在引物上呢，也能突变缺失吗？会不会是引物本身少了C导致的，虽然检测报告写的正常。
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1楼 2016-12-06 14:04:15
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781055707

木虫 (著名写手)
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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-12-07 06:25:05
Ivy尘: 金币+1 2016-12-07 09:37:04
做的实验多了，难免碰上坑。
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采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2016-12-06 16:39:26
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Ivy尘

新虫 (正式写手)
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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-12-07 06:24:47

泪流满面
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2楼2016-12-06 14:21:46
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Ivy尘

新虫 (正式写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-12-07 06:24:53
生工说要重新给我合成引物，妈蛋，要是是引物问题，我就要气死了
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3楼2016-12-06 15:04:19
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Ivy尘

新虫 (正式写手)
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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-12-07 06:25:32
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4楼: Originally posted by 781055707 at 2016-12-06 16:39:26
做的实验多了，难免碰上坑。

最近光掉坑了……

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5楼2016-12-06 18:27:53
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-12-07 06:25:43
我的测序开头多了个碱基c

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知识就像蒲公英的花儿一样，播种在世界的每一个角落。
6楼2016-12-06 18:37:40
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Ivy尘

新虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by sky蒲公英 at 2016-12-06 18:37:40
我的测序开头多了个碱基c

载体上的吗？

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7楼2016-12-06 22:27:01
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-12-07 06:25:57
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7楼: Originally posted by Ivy尘 at 2016-12-06 22:27:01
载体上的吗？
...

不是，我的是插入片段。在测序结果刚开始的10bp里多。

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8楼2016-12-06 22:30:14
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-12-07 06:26:44
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8楼: Originally posted by sky蒲公英 at 2016-12-06 22:30:14
不是，我的是插入片段。在测序结果刚开始的10bp里多。
...

是菌液测序的。只测了插入片段

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9楼2016-12-06 22:31:11
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kungfu2016

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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-12-07 06:26:49
Ivy尘: 金币+1 2016-12-07 09:37:15
引物本身有问题吧

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10楼2016-12-06 23:01:31
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