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蛋白质连接技术
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含羟基的小分子蛋白的交联 这一类小分子包括糖、核苷酸、酚和醇，一般不能直接用于与蛋白的结合。将醇转变成琥珀酸半酯(半琥珀酸盐)则衍生了一个可用于结合的羧基，这种方法已用于许多小分子与蛋白的耦联。此外，双功能试剂葵二酰二氯(sebacoyldichloride)可将醇转变成氯酸，氯酸在pH8．5时，很容易与蛋白发生耦联反应。 1．醇羟基通过半琥珀酸盐的形成而转变成羧基 目的：使含羟基的醇易于与蛋白耦联。 操作步骤： (1)将15g 2，2，2—三氯乙醇(trichloroethan01)、12g琥珀酸酐(succinic anhydride)和8．7ml三乙胺(triethylamine)溶于100 ml乙酸乙酯； (2)加热及回流1h； (3)蒸发溶剂，用5％Na2C03水溶液溶解残渣； (4)用乙醚洗2次，然后再用H：S04调pH至2．0； (5)用水洗最后的固体(2，2，2—三氯乙酰半琥珀酸盐)2次，然后从氯仿—己烷中重结晶(产率约为75％，熔点88～900C)： (6)加2．5g半琥珀酸盐至6．5 ml亚硫酰氯(thionylchloride)中，65~C加热30min； (7)真空蒸发至干，置残渣于高真空下1 h； (8)用15 m1N，N—二甲基乙酰胺溶解固体(2，2，2—三氯乙酰琥珀酰氯)，与2．79g小分子的羟基，即1—p—D-arabinofuranofuranosylcytosine的5，—OH反应，室温搅拌2 h； (9)65~C毒真空下蒸发，再从异丙醇中重结晶(产率：约84％的结晶5，酯以盐酸盐形式存在，熔点1600C)； (10)为得到小分子—半琥珀酸盐，用溶于DMF的锌和醋酸裂解三氯乙酯，因此，衍生的羧基可使用诸如碳二亚胺的方法结合于蛋白上。 酚则可用重氮化的对氨基苯酸活化，于是对氨基苯酸可引入一个羧基，然后再通过混合酸酐的反应耦联载体蛋白或酶分子。 糖可通过Landsteiner方法活化，形成一种对硝基苯葡萄糖苷，接着硝基还原，重氮化后形成结合。还有一个简单的方法是将糖的邻近乙二醇氧化裂解成醛基，醛基然后通过还原性烷基取代而结合至氨基上。这种方法已成功地用于核苷、核苷酸和地高辛与蛋白的耦联。 2．使用NaIO4‘氧化糖类小分子邻近乙二醇而耦联腺苷与—半乳糖苷酶 目的：使糖类小分子能与蛋白耦联。 操作步骤： (1)溶解20 mg腺苷(adenosine)于1 m1 100 mmol／LNal04溶液中，4~C暗处反应30rain； (2)加1滴乙二醇； (3)将氧化好的腺苷加至p—半乳糖苷酶溶液(20 mg／m1 150mmol／L NaCl和10 mmo!／L MgCl2，用K2C03调pH至9．0)中； (4)40C反应2 h，保持pH 9．0； (5)加入1／10体积的新鲜制备的NaBH，(50mg／m1)，40C反应过夜； (6)用含10mmol／LMgCl2，10mmoi／L 2—ME和10mmo!／LNaCi的50mmol／LPB(pH7．4)缓冲液透析。 |
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