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新虫 (初入文坛)


[交流] 扫描电镜与投射电镜实验方法整理交流 已有4人参与

透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)是使用最为广泛的一类电镜。通过发射电子束从而穿过超薄的样品,同时与样本相互作用,既而形成图像。透射电镜具有分辨率高和放大倍数高的优点。其分辨率为0.1~0.2nm,放大倍数为几万到几十万倍。目前透射电镜已经广泛的应用到癌症研究,病毒学研究,微生物学,细胞学研究等生物领域。透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像,投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。电子与样品中的原子碰撞而改变方向,从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关,因此可以形成明暗不同的影像。由于电子易散射或被物体吸收,故穿透力低,必须制备超薄切片(通常为50~100 nm)。要在机体死亡后的数分钟内取材,组织块要小(1mm3以内),常用戊二醛和锇酸双重固定,包埋介质包埋,用超薄切片机切成薄片,再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色。
         扫描电镜是1965年发明的较现代的细胞生物学研究工具,它具有制样简单、放大倍数可调范围宽、图像的分辨率高、景深大等特点。近年来,扫描电镜已广泛地应用在生物学、医学、等学科的领域中。 主要是通过发射电子聚焦光束来扫描样品的表面形态.电子束与样品表面的样子发生作用,产生多种能够被检测的信号,这些信号就包含了样品的表面形态和组成.染色。
实验流程
1. 样品的初步处理
a.取材样品面积可达8mm×8mm,厚度可达5mm。对于易卷曲的样品如血管、胃肠道粘膜等,可固定在滤纸或卡片纸上,以充分暴露待观察的组织表面。
b.样品的清洗
(1)用等渗的生理盐水或缓冲液清洗;
(2)用5%的苏打水清洗;
(3)用超声震荡或酶消化的方法进行处理。
c. 固定
固定所用的试剂和透射电镜样品制备相同,常用戊二醛及锇酸双固定。由于样品体积较大,固定时间应适当延长。也可用快速冷冻固定。
d. 脱水
样品经漂洗后用逐级增高浓度的酒精或丙酮脱水,然后进入中间液,一般用醋酸异戊酯作中间液。
2. 样品的干燥
a.空气干燥法
空气干燥法又称自然干燥法,就是将经过脱水的样品,让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。这种方法的最大优点是简便易行和节省时间;它的主要缺点是在干燥过程中,组织会由于脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。因此,该方法一般只适用于表面较为坚硬的样品。
b. 冷冻干燥法
(1)置于冷冻保护剂中:将样品置于冷冻保护剂中浸泡数小时。常用的冷冻保护剂为10%~20%二甲基亚砜水溶液,或15%~40%甘油水溶液。
(2)骤冷:将经过保护剂处理的样品迅速投入用液氮预冷至(150℃的氟利昂冷冻剂中,使样品中的水分很快冻结。
(3)干燥:将已冻结的样品移到冷冻干燥器内已预冷的样品台上,抽真空,经几小时或数天后,样品即达到干燥。本方法不需要脱水,避免了有机溶剂对样品成分的抽提作用,不会使样品收缩,也是较早使用的方法。但是,由于花费时间长,消耗液氮多,容易产生冰晶损伤,因此未被广泛应用。
3. 样品的导电处理(真空镀膜法)
        真空镀膜法是利用真空膜仪进行的。其原理是在高真空状态下把所要喷镀的金属加热,当加热到熔点以上时,会蒸发成极细小的颗粒喷射到样品上,在样品表面形成一层金属膜,使样品导电。喷镀用的金属材料应选择熔点低、化学性能稳定、在高温下和钨不起作用以及有高的二次电子产生率、膜本身没有结构。现在一般选用金或金和碳。为了获得细的颗粒,有用铂或用金-钯、铂-钯合金的。金属膜的厚度一般为10 nm~20 nm。真空镀膜法所形成的膜,金属颗粒较粗,膜不够均匀,操作较复杂并且费时,目前已经较少使用。4. 拍摄
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扫描电镜与投射电镜实验方法整理交流-1
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科学小蜜蜂

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我们现在在从事生物这块的检测,作者说的很全面,点个赞。

发自小木虫Android客户端
2楼2016-11-21 18:38:02
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北藐cdut

银虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
内容已删除
坦然
3楼2016-12-25 21:02:34
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976307597

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你好,有问题想向你请教, 我的实验是观察鱼体细胞的膜磷脂双分子层的变化,前处理是用TF-2型冻结割断器处理,使用液氮。可具体操作就不知道了,您能给我些建议吗
4楼2017-05-17 20:20:30
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乖乖好99

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你好,你上面提到的样品冷冻干燥方法,也需要经过戊二醛干燥吗?如果直接经缓冲液清洗以后直接冷冻干燥可以吗?
爱笑的女孩运气不会太差
5楼2018-01-08 15:40:27
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