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棉子糖

铁虫 (初入文坛)

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[交流] 什么样的lncRNA研究能登顶Science

长链非编码RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA。LncRNA一直是研究的热点，其作用机制多元，并不像miRNA那样具有固定的模式，这也是研究的难点之一。

那如何去开展LncRNA研究呢？

在转录组研究中，研究思路不外乎高通量测序，差异表达分析，选择感兴趣的基因进行功能研究。在上篇推文中，作者生理实验加生信分析，做到功能预测这一步，就发了4.5分SCI，那如何发高一点，再高一点的SCI呢？

今天就一起来看看Science上的lncRNA研究是如何做的。

文章案例
The STAT3-binding long noncoding RNA lnc-DC controls human dendritic cell differentiation
研究领域：免疫       相关基因: lnc-DC，STAT3          PMID: 24744378
杂志：Science       IF: 34.661             样本：GSE54143 ，GSE54401

这篇文章主要探究lncRNA在树突细胞（dendritic cell，DC）分化及功能中的作用。作者发现了一个关键的lncRNA(lnc-DC)，并用实验验证了其功能和作用机制，思路图如下：

图1 文章思路图（mono指单核细胞monocytes，DC指树突细胞Dendritic cells；DC由mono分化而来的）

那为啥就能发Science呢？

发science首先立意要新，作者研究的是lncRNA在DC细胞分化和功能中的作用，在当时14年很少有lncRNA在免疫方面的研究。且2011诺贝尔生理学/医学奖授予的就是树突细胞研究者。树突细胞能递呈抗原，激发T细胞应答，可通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的树突细胞回输给病人，诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应，所以DC在肿瘤的免疫治疗中具有巨大的应用前景。

其次要有新的重大的发现。作者发现了lncRNA在细胞质中一种新的作用机制，其直接结合信号分子来调节翻译后修饰，在当时拓宽了对lncRNA作用机制的认识。

最后还需要系统严谨的实验作为支撑。作者从最初lncRNA的筛选，验证，到目标lncRNA自身特性，表达和功能机制的研究，可以说在lncRNA的研究上已经很深入，也很系统。实验一环扣一环，正反证，反正证，真正是用实验结果堆出来的文章。

下面具体看下作者是如何一步步做lncRNA的研究的。

1、筛选lncRNA
作者首先用芯片HTA 2.0 transcriptome microarray assay检测了mono分化至DC过程中(7天)lncRNA的表达变化，在124个显著变化的lncRNA中（fold change>16，p<0.05），有24个被诱导。

图2  DC分化过程中lncRNA热图

为确保结果的准确性和可靠性，作者又用二代测序Illumina HiSeq 2000 检测了0点和第7天的lncRNA表达情况，99个lncRNA差异显著(fold>4,FDR<0.05)。

图3 二代测序lncRNA表达情况（红色为显著差异，fold>4,FDR<0.05）

对两个结果取交集，筛选了表达倍数高的lnc-DC作为下一步的研究对象。

2、验证lnc-DC
为确保结果的准确性，进一步用Northern blot对lncDC的表达进行了验证，确证lnc-DC在DC分化过程中的高表达。在验证这一步，还可以选择qPCR，两者各有优缺点，可以自行选择合适的方法。

图4 lnc-DC的Northern blot验证结果

3、 Lnc-DC自身特性研究
可对目标lncRNA进行基因组定位，序列保守性，全长及结构等方面进行研究。

基因组定位
可用Genome browser对lnc-DC进行基因组定位，并查看其临近基因。调控邻近基因表达是lncRNA的一种作用机制。
Genome browser http://genome.ucsc.edu/

序列保守性估计
可用PhastCons进行序列保守性估计。
PhastCons http://genome.ucsc.edu/

图5 lnc-DC和邻近基因HEATR6序列的保守性估计

转录起始位点、结束位点及全长验证
可用RACE进行转录起始位点和结束位点及全长验证

图6 RACE进行转录起始位点和结束位点及全长验证结果

结构解析
可用RT-PCR进行5‘端和3’端结构探究，发现lnc-DC有poly A尾和5‘端帽子。

图7 RT-PCR验证lncDC结果

编码能力验证
将lnc-DC转入HEK293T细胞进行表达验证，其无编码能力，同时用生信方法对其序列进行编码能力预测，与实验结果一致。
Coding potential calculator http://cpc.cbi.pku.edu.cn/programs/run_cpc.jsp

图8 lnc-DC编码能力验证结果（左，片段构建；右，免疫印迹结果）

4、表达研究
表达特异性
作者选取其他免疫细胞进行比对，分别通过实验及数据库中的数据分析，发现lnc-DC只在cDC（conventional DC）中特异性表达。

图9 lnc-DC在不同细胞中表达结果

表达机制研究
组蛋白修饰可调控基因表达，作者采用CHIP-seq和CHIP-qPCR进行组蛋白修饰研究，并通过DNAase I 的敏感性来衡量染色质的疏松状态。在lnc-DC位点组蛋白H3K4me3和H3K27ac修饰，染色质较为疏松的状态及转录因子PU.1促进了lnc-DC在cDC中的特殊表达。

图10 lnc-DC表达机制研究结果

5、 Lnc-DC功能研究
功能探索
作者用RNAi敲除及过表达来研究lnc-DC的功能，敲除和过表达结果相反。敲除lnc-DC后，作者分别从基因、蛋白的表达及功能的影响来考察lnc-DC的功能。最后表明lnc-DC促进了DC的分化，对DC抗原的递呈及增加T细胞增殖上具有重要作用，同时小鼠体内外实验也有相同结论。

图11 lnc-DC RNAi基因表达结果

图12 lnc-DC RNAi蛋白表达结果

图13 lnc-DC RNAi后DC抗原递呈能力（左）及激活T细胞增殖情况（右）

机理研究
在机理研究中，可用排除法，先考察是否和目前报道的作用机制一致。

LncRNA的作用机制中，其中有cis顺式调控和trans反式调控。Cis顺式调控影响邻近基因的表达，在之前的实验环节，发现lnc-DC敲除对邻近基因表达没有影响，可排除lnc-DC cis顺式调控作用。

接下来作者用FISH对lnc-DC进行细胞定位，显示lnc-DC处于细胞质中。LncRNA在细胞质中有两种作用方式，可作为ceRNA与miRNA结合恢复mRNA的翻译，或与ALU元件作用促进STAU1介导的mRNA衰退。RNA免疫沉淀（RIP）表明lnc-DC不与AGO2作用，排除了lnc-DC和miRNA的作用机制。用生信分析表明lnc-DC没有与ALU的作用序列，所以lnc-DC有新的作用机制。

作者用pull-down（蛋白质体外结合实验）联合MS发现lnc-DC与STAT3（转录因子）相互作用，并用系列实验找出了lnc-DC和STAT3的作用位点及调节方式，详细过程请参见文献。下图是作者推测的lnc-DC的作用机制模拟图。

图14 DC分化过程中lnc-DC的作用机制模型

在mono分化至DC的过程中，组蛋白H3K4me3和H3K27ac的增加伴随着染色质的疏松，促进转录因子PU.1的结合，增强了lnc-DC的表达。lnc-DC转录后即转运至细胞质，与STAT3结合，阻止了SHP1对STAT3的去磷酸化，增强了STAT3的信号通路，最终促进了DC细胞的分化。

在这简单梳理了作者的研究思路，从lncRNA的筛选，验证到功能机理研究，详细可参见文献。

这篇文章对我们有什么启发呢？

首先立意一定要新，想想有什么热点是可以与自己的研究方向结合的。其次是严谨的思路和系统的实验，这些是完全可以参照和套用的。14年lncRNA研究的science的标准在这，请大家用心体会……

LncRNA方法总结
LncRNA筛选
芯片 HTA 2.0  human transcriptome microarray assay
      MTA 1.0 mouse transcriptome microarray assay
测序

LncRNA验证
Northern blot/qPCR

目标lncRNA研究
基因组定位 genome browser http://genome.ucsc.edu/
序列保守性估计 PhastCons http://genome.ucsc.edu/
转录起始位点，终止位点验证及全长克隆 RACE
结构解析 PT-pcr
编码能力预测转基因-免疫印迹

LncRNA表达
表达特性
Northern blot/qPCR
数据库数据
表达机理
组蛋白修饰——CHIP-seq/CHIP-qPCR
染色质状态——DNAase I
序列分析

LncRNA功能
敲除/过表达
RNA 免疫印迹（RIP）
Pull down实验

拓展知识
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图1 文章思路图