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[交流]
人肿瘤抗原的识别与鉴定实验
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实验材料 肿瘤细胞 试剂、试剂盒 PBS、生理盐水、裂解液、蛋白酶抑制剂 仪器、耗材 培养瓶、细胞刮棒、离心管、低温离心机、-80℃冰箱、探针型超声波、恒温水浴锅 实验步骤 一、 裂解细胞 1. 方向刮取细胞。将细胞悬液转移到离心管，离心取沉淀，-80℃ 保存。（收集细胞要迅速，低温下进行，以减弱蛋白酶的作用） 2. 裂解细胞。采用RIPA 裂解体系，使用前40℃ 预冷，按107 个细胞加入1.0 ml 裂解液，吹打混匀，加入适量的蛋白酶抑制剂 （如cocktail）， 冰上放置3~5 分钟。 3. 超声处理裂解液。使用探针型超声进行多次适当频率的短促冲击，10~20秒/次，重复3 次，中间间隔10~20 秒，冰浴下进行。 4. 15 000 rpm，40℃离心15 min，吸取上清液于另一EP管中，置冰上。上清液用于下一步的预处理。 二、裂解物的预处理 使用正常人的血清对裂解物进行预处理。 1. 按1 ml 裂解物加2 μl 对照血清的比例加入正常人血清。 2. 室温孵育2~3 小时，缓慢摇动。 三、免疫复合物的纯化 1. 用Dynabeads protein A 进行免疫复合物的纯化。 2. 将Dynabeads protein A 振荡混匀，吸取100 μl磁珠于EP 管中，置于磁铁架（Dynal MPC）上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。 3. 加500 μl 0.1 M Na-phosphate (pH8.1 )至Ep 管，轻柔搓动管子约2~3 min，将EP管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。 4. 重复2 步骤两次。 5. 清洗完磁珠后，加500 μl 预处理后的裂解物，反复摇动管子，室温下反应10~20 min。 6. 将EP管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，将上清转移至另一EP管中。 7. 用RIPA 裂解液清洗磁珠3 次。 8. 洗脱抗原-抗体复合物。加0.1 M citrate (pH3.1) 30 μl于Ep 管中，轻柔搓动管子约2~3 min，将P管置于磁铁架上，吸取上清于一EP管。 9. 重复步骤7，将上清收集于同一个EP管洗脱样品总体积为60 μl，作对照用。 10. 磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后备用。 11. 在步骤5 留取的上清中加入病人血清（1 ml 加2 μl 血清），缓慢摇动，室温孵育2~3 h。 12. 将EP管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。 13. 重复步骤6~8。共收集到两份样品，对照与病人的纯化免疫复合物各60 μl。 14. 磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后加入柱储液100 μl，40℃ 保存。 15. 在样品中加入2×SDS 上样缓冲液并用1 M NaOH 调节pH 至使溴酚蓝呈蓝色。 四、结果分析 1. 1D SDS-PAGE用免疫沉淀后的样品可直接进行一维凝胶电泳，或者对磁珠上的蛋白A 或蛋白G 进行耦联剂修饰，洗脱后的样品可进行Western Blot。 2. RIPA裂解液： 150 mmol/L NaCl；1.0%NP-40；0.5%脱氧胆酸钠； 0.1%SDS ；50 mmol/L Tris（ pH8.0）。 |
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