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血基因组DNA提取实验 已有4人参与
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血基因组DNA提取可以： （1）从冻全血、血浆、血清、骨髓、其他体液、淋巴细胞、培养细胞、病毒和线粒体中提取DNA； （2）用于后续测序、遗传信息学等研究。 实验方法原理 本试剂盒采用特殊的细胞裂解和蛋白去除液（包括蛋白酶K 裂解）从抗凝全血中得到基因组DNA。适用于从冻全血、血浆、血清、骨髓、其他体液、淋巴细胞、培养细胞、病毒和线粒体中提取DNA。 实验材料 抗凝全血 试剂、试剂盒 血基因组DNA 试剂盒 仪器、耗材 96孔深孔板、96圆孔板、96孔DNA制备板、96圆孔硅胶片、BF-400膜 实验步骤 一、试剂盒组成、贮存、稳定性 1. 说明书，耗材：96孔深孔板（1.6 ml），96圆孔板，96孔DNA制备板，96圆孔硅胶片，BF-400膜。 2. Proteinase K：冻干的蛋白酶K 可室温贮存6 个月，长时间保存请置于4℃；溶解后，在2-8℃可贮存2 个月，长时间保存请勿置于室温中。 3. Buffer PK ：蛋白酶K 溶解液，室温密闭贮存。 4. Buffer BL ：细胞裂解液，室温密闭贮存。 5. Buffer W1B concentrate ：洗涤液。使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。 6. Buffer W2 concentrate ：去盐液。使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。 7. 10×Buffer W2（12×96 试剂盒）：用于配制Buffer W2 。 8. Eluent B：7.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，0.3 mM EDTA ，室温密闭贮存。 二、实验准备 1. 第一次使用时，在Buffer W2 concentrate 和Buffer W1B concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。 2. Buffer W2（12×96 试剂盒）配制：在提供的500 ml 空瓶中加入15 ml 10×Buffer W2，135 ml 去离子水和350 ml 乙醇，可用100%无水乙醇或95%乙醇。 3. 根据瓶上标签将蛋白酶K 溶解于Buffer PK 中，请勿旋涡振荡。 4. 准备70℃温浴。 5. 使用前检查Buffer BL 是否有沉淀析出，若出现沉淀，请于70℃温浴加热至沉淀完全溶解后再使用。 三、操作步骤 1. 向96 圆孔板的每孔中加入20 μl 蛋白酶K。 2. 加200 μl 抗凝全血到96 圆孔板中。 * 若全血样品体积少于200 μl，用PBS 补充到200 μl。 * 若样品为鸟类血，样品用量须低于10 μl。 * 若需得到RNA-free 的基因组DNA，在步骤3 加入Buffer BL 前加入DNase-free 的RNase A(20 mg/ ml) 。 3. 加200 μl Buffer BL ，注意不要打湿每孔的边缘，用96 圆孔硅胶片密封各孔。 4. 用力混合30 s。 5. 3000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到96圆孔板内。启动离心机，当速度达到3000rpm后即停止。 6. 在培养箱或烘箱中70℃温浴至少10 min。 7. 3 000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到96圆孔板内。启动离心机，当速度达到3 000rpm后即停止。 8. 取下96 圆孔硅胶片，每孔加入200 μl 乙醇（96-100%）。 9. 用96 圆孔硅胶片密封各孔，用力混匀混合15 s。3 000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到圆孔板内。启动离心机，当速度达到3 000 rpm 后即停止。 10. 将96 孔DNA 板放到一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板。取下圆孔板上的96 圆孔硅胶片，将每孔中的溶液转移至96 孔DNA 板 中，6 000 rpm 离心4 min。 11. 丢弃96 孔1.6 ml 深孔板的滤液，将96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入500 μl Buffer W1B，用一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板，6 000 rpm 离心4 min。 * 确认在Buffer W1B concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 12. 丢弃96 孔1.6 ml 深孔板的滤液，将96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入850 μl Buffer W2，用另一新 的BF-400膜密封96孔DNA板，6 000 rpm 离心4 min。 * 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 13. 弃滤液，将96孔DNA板放回到96孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入400 μl Buffer W2， 用另一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板，6 000 rpm 离心4 min。 14. 将96孔DNA板放在一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板上，用BF-400膜密封96孔DNA板，6 000 rpm离心15 min。 15. 将96孔DNA板放在另一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板上，每孔加入100-200 μl Eluent B 或去离子水，室温静置2 min，用另一新的BF-400膜密封96 孔DNA板，6 000 rpm 离心4min洗脱得到DNA。 DNA 注意事项 1. Buffer BL 和Buffer W1B 含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水和生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。 |
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