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Nigori

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[交流] 利用PCR分析酵母菌落已有2人参与

实验方法原理

用 PCR 分析酵母菌落时，无需纯化 DNA。本方案以单个酵母菌落的粗裂解液作为 PCR 扩增的模板，来确定 YAC 中是否携带目的 DNA 序列。

实验材料 Taq DNA 聚合酶、寡核苷酸引物、DNA 标准参照物、YAC 重组子的酵母菌株

试剂、试剂盒 PCR 缓冲液、dNTP 溶液

仪器、耗材琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶、微量离心管、程控式 PCR 仪

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

10X 菌落 PCR 缓冲液

dNTP 溶液（10 mmol/L), 含有 4 种 dNTP ( pH 8.0，PCR 级）

MgCl2 ( 25 mmol/L)

2. 酶及其缓冲液

Taq DNA 聚合酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶

4. 核酸和寡核苷酸

寡核苷酸引物

DNA 标准参照物

5. 专用设备

微量离心管（0.5 ml)

储存有所需 PCR 方案的程控式 PCR 仪

6. 载体和酵母菌株

携带有目的 YAC 重组子的酵母菌株

二、方法

1. 在一个无菌的 0.5 ml 微量离心管里，依次序加入下列物质：10X 菌落 PCR 缓冲液 2 μl，25 mmol/L MgCl2 1.2 μl，10 mmol/L dNTPs 0.4 μl，寡核苷酸引物每个引物浓度为 10 pmol，Taq 聚合酶 5 单位（0.2 μl），H2O 加至总体系为 20 μl。

2. 用一个黄色的一次性移液器吸头，吸取少量酵母菌落 ( 0.10~0.25 μl )，加入反应体系。

3. 将 PCR 管放进 PCR 仪内。按下面程序进行 PCR 反应。

4. 用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR 产物。电泳应采用适宜大小的标准参照物。

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