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利用PCR分析酵母菌落 已有2人参与
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实验方法原理 用 PCR 分析酵母菌落时，无需纯化 DNA。本方案以单个酵母菌落的粗裂解液作为 PCR 扩增的模板，来确定 YAC 中是否携带目的 DNA 序列。 实验材料 Taq DNA 聚合酶、寡核苷酸引物、DNA 标准参照物、YAC 重组子的酵母菌株 试剂、试剂盒 PCR 缓冲液、dNTP 溶液 仪器、耗材 琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶、微量离心管、程控式 PCR 仪 实验步骤 一、材料 1. 缓冲液和溶液 10X 菌落 PCR 缓冲液 dNTP 溶液（10 mmol/L), 含有 4 种 dNTP ( pH 8.0，PCR 级） MgCl2 ( 25 mmol/L) 2. 酶及其缓冲液 Taq DNA 聚合酶 3. 凝胶 琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶 4. 核酸和寡核苷酸 寡核苷酸引物 DNA 标准参照物 5. 专用设备 微量离心管（0.5 ml) 储存有所需 PCR 方案的程控式 PCR 仪 6. 载体和酵母菌株 携带有目的 YAC 重组子的酵母菌株 二、方法 1. 在一个无菌的 0.5 ml 微量离心管里，依次序加入下列物质：10X 菌落 PCR 缓冲液 2 μl，25 mmol/L MgCl2 1.2 μl，10 mmol/L dNTPs 0.4 μl，寡核苷酸引物 每个引物浓度为 10 pmol，Taq 聚合酶 5 单位（0.2 μl），H2O 加至总体系为 20 μl。 2. 用一个黄色的一次性移液器吸头，吸取少量酵母菌落 ( 0.10~0.25 μl )，加入反应体系。 3. 将 PCR 管放进 PCR 仪内。按下面程序进行 PCR 反应。 4. 用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR 产物。电泳应采用适宜大小的标准参照物。 |
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