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GLUTOON

新虫 (初入文坛)

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[求助] 原肌球蛋白纯化已有1人参与

现在刚开始学着提取原肌球蛋白，但是毫无进展QAQ，大神们给分析下，到底哪不对
1) 南美白对虾肌肉总蛋白提取
将 25 g 虾肉放进研钵，加入液氮立即研磨至粉末，加入了约80ml体积提取缓冲液tris-HCL，搅拌均匀，4 ℃浸泡16 h；14000转 4  ℃离心 15 分钟，取上清，即为南美白对虾总蛋白提取液。
2) 原肌球蛋白的分离纯化
将粗处理过的虾肉分别用 Buffer A（50 mmol/L KCl 和 2 mmol/L NaHCO3）抽提，14000转 4 ℃离心 10 分钟，然后按理说应该有蛋白沉淀的，可是一点都没有，澄清的很。
然而，下面是我找的说的很含糊文献。
1) 南美白对虾肌肉总蛋白提取
将 25 g 虾肉放进研钵，加入液氮立即研磨至粉末，加入了约80ml体积提取缓冲液tris-HCL，搅拌均匀，4 ℃浸泡16 h；4 ℃离心，取上清，即为南美白对虾总蛋白提取液。
2) 原肌球蛋白的分离纯化
将粗处理过的虾肉分别用 Buffer A（50 mmol/L KCl 和 2 mmol/L NaHCO3）抽提，4 ℃离心，取沉淀重复操作 4 次；丙酮搅拌过滤；Buffer B（20 mmol/L Tris-HCl即三（羟甲基）氨基甲烷）、1 mol/L KCl 和 10 mmol/L β-巯基乙醇）抽提，4 ℃离心，取上清；调节 pH 至 4.5，充分沉淀，并加入 41%（NH4）2SO4，4 ℃离心；重复 41%（NH4）2SO4 盐析后，加入 60%（NH4）2SO4，溶液于 4 ℃离心，取沉淀；Buffer B 溶解沉淀后，100 ℃水浴加热，溶液于 4℃离心；对上清调节 pH 至 4.5，充分沉淀；4 ℃离心；沉淀用 Tris-HCl 溶解。@hc-material

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