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蛋白质检测之免疫共沉淀 已有1人参与
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1楼 一、原理： 免疫共沉淀（Co-IP）是以研究蛋白质相互作用的经典方法，其原理基础为抗体-抗原之间的专一性作用。在分子病理生物学研究领域，Co-IP是用以确定两种蛋白在完整细胞内生理性相互作用的常用方法。其技术原理为：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来，如果用蛋白质N的抗体免疫沉淀N，那么与N在体内结合的蛋白质M也能沉淀下来。目前多用于精制的蛋白A预先结合固化在琼脂糖的珠子（Beads）上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的蛋白A就能吸附抗原到精制的目的。Co-IP主要用于测定两种目标蛋白质在体内的结合情况，也用于确定一种特定蛋白质的新的结合蛋白。 二、具体步骤： 1. 细胞用预冷的PBS液洗涤2次，最后洗涤完成后吸干PBS液。 2. 加入预冷的RIPA Buffer（1ml/107个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）。 3. 刮留细胞：用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶中上刮下，将悬液转入1.5mlEP管中，EP管插冰上，置于水平摇床上缓慢晃动15min。 4. 4℃，14000g离心15min。 5. 立即将上清液转移到一个新的离心管中。 6. 准备Protein A琼脂糖，用PBS液洗两遍珠子，然后用PBS液配制成50%浓度。 *为避免操作中破坏琼脂糖珠，减掉移液器枪头的尖部分。 7. 每ml总蛋白中加入100ul Protein A琼脂糖珠（50%），EP管插冰上，置于水平摇床上4℃摇晃10min。 *目的是去除非特异性杂蛋白，可降低背景。 8. 4℃，14000g 离心15min，将上清转移到一个新的离心管中。 9. 测定蛋白浓度，可选用Bradford法做蛋白标准曲线。 10. 蛋白定量，分装，-20℃保存，可保存1个月。 11. 用PBS液将总蛋白稀释至约1ug/ml。 12. 加入500ul稀释好的兔抗到总蛋白中。 13. 于摇床上4℃缓慢摇动抗原抗体混合物，可选择过夜或室温放置2h。 加入100ul Protein A琼脂糖珠用以捕捉抗原抗体复合物，摇床4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或者室温孵育1h。 15. 14000rpm瞬时离心5s，去上清，收集琼脂糖珠-抗原抗体的复合物。 16. 用800ul预冷RIPA buffer冲洗3遍。 17. 用60ul 2倍上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻敲打混匀。 18. 将上样样品煮5min。 19. 14000g离心，收集剩余琼脂糖珠。 20. 将上清电泳，电泳前应再次煮5min变性。 21. 上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳。 三、优缺点 优点： 1.于天然状态下相互作用的蛋白质。 2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响。 3.分离得到相互作用蛋白的天然符合物。 缺点： 1.低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用可能检测不到。 2.两种蛋白质的结合可能有第三者参与，而非直接结合。 实验前预测可能的结合蛋白非常重要，以此选择最后检测的抗体，若预测不准确，实验就得不到结果，方法本身存在风险。 |
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