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溶血空斑试验
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实验方法原理 溶血空斑试验，又称空斑形成细胞（Plague Forming Cell, PFC）试验，是一种体外检测抗体形成细胞的方法。将一定量洗涤过的绵羊红细胞注射入小鼠腹腔，四天后将小鼠杀死，取脾脏制成脾细胞悬液，内含抗体形成细胞。然后将脾细胞、绵羊红细胞，补体混合孵育。由于PFC 所分泌的抗体和绵羊红血球结合形成抗原抗体复合物，在补体作用下可使红细胞溶解，于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑。一个空斑即代表一个抗体形成细胞。 实验材料 ICR小鼠 试剂、试剂盒 绵羊红血球、补体 仪器、耗材 解剖器械、试管、吸量管、载玻片、石蜡盘、酒精灯、微量加样器 实验步骤 1. 小鼠免疫及脾细胞悬液的制备 将5 ％SRBC0.4 ml注射于小鼠腹腔，4 天后拉脱颈椎处死，取出脾脏放在已加入6 ml Hank's液的平皿中。在100 目不锈钢网上研磨，过滤混匀，从中吸取1 ml加入试管中，加满Hank's液混匀，离心1000 rpm，10 分钟。将沉淀的脾细胞恢复1 ml容积，即为约1×107 /ml浓度的细胞悬液。 2. 制作小室 取无脂载玻片（75 mm×25 mm）, 平置桌面上。用双面胶带在载玻片两端和中间各粘一条，然后再覆盖上同样的载玻片，即形成两个小室。将此双层玻片的一侧长边浸入融化的石腊池中以封闭小室的一边（无需浸入过深，以能封闭小室边缘为准）。 3. 小室灌注细胞悬液 取 1×107 /ml脾细胞悬液100 μl 10 ％SRBC 200 μl 新配补体 200 μl Hank's液 1 ml 混匀后，用尖吸管灌注小室、蜡封、标记、平放于玻片盘内，置37 ℃孵箱30—45 分钟。 注意事项 1. 小室注入液体时不要留有气泡。 2. 小室边缘需用石蜡封严。 3. 37℃孵箱孵育时，必须放平，不可倾斜。 4. 观察结果时，应注意辨别空斑与气泡的区别，避免将气泡误认为溶血空斑。 |
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