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ShuiRn

新虫 (初入文坛)

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[求助] 【GUS染色】如何解决假阳性问题已有2人参与

我的材料是无菌播种的拟南芥幼苗，严格按照老师的方法做，可是WT与阳性苗的现象几乎一样，只是颜色淡些，请问大家有没有什么窍门可以避免幼嫩组织产生假阳性？

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1楼 2016-10-17 12:53:21

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虫虫很白

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

对于这个问题我认为你得慢慢摸索

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2楼2017-01-03 20:30:54

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lixg

铁杆木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
ShuiRn: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 谢谢 2017-03-02 20:53:46

以下是我们实验室的方法（提高K3[Fe(CN)6]和 K4[Fe(CN)6]的浓度；用冰预冷的90% 丙酮轻微固定降低内源---）
GUS染色分析
参照 Sieburth和Meyerowitz (1997) 的报道并略有改动。
具体步骤如下：样品用冰预冷的90% 丙酮轻微固定（在冰浴中）10-15分钟，然后经缓冲液A（50 mM 磷酸缓冲液，pH 7.2，5 mM 铁氰化钾K3[Fe(CN)6]，5 mM亚铁氰化钾K4[Fe(CN)6]，0.5% Triton X-100）清洗数次。接着将样品投入GUS染色液(2 mM X-Gluc 溶解于缓冲液A中)，抽真空10分钟（冰浴中），37℃ 温浴2小时直至过夜（根据不同材料的染色程度而定）。染色后经系列乙醇脱水(30%乙醇、FAA固定、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇。每级乙醇30分钟—1小时，FAA固定1小时)。
脱水后的材料可直接用Hoyer’s透明剂（Liu and Meinke, 1998）透明、封片。为进行切片观察，一部分脱水后的材料经二甲苯透明、石蜡包埋（同一般的石蜡切片处理步骤）、切片、脱蜡、复水（100%、100%、95%、85%、70%、50%、30%、ddH2O，每级2-5分钟）、钌红衬染、脱水（30%、50%、70%、85%、95%、100%、100%乙醇，每级2-5分钟）、透明（1/2 100% 乙醇+1/2二甲苯、二甲苯、二甲苯，每级5分钟，）、中性树脂封片。

配方：
1. 缓冲液A： 50ml配方
终浓度
1M Na2HPO4    1.6 ml
1M KH2PO4    0.9 ml          50 mM NaKPO4 buffer  pH7.2
0.1M  K3[Fe(CN)6]  2.5 ml             5 mM
0.1M  K4[Fe(CN)6]  2.5 ml             5 mM
Triton X-100       0.05ml             0.1%
Add ddH2O to 50 ml
2.  GUS染色液： 50 ml配方
                                       终浓度
1M Na2HPO4    1.6 ml
1M KH2PO4    0.9 ml          50 mM NaKPO4 buffer  pH7.2
0.1M  K3[Fe(CN)6]  2.5 ml             5 mM
0.1M  K4[Fe(CN)6]  2.5 ml             5 mM
Triton X-100    0.05ml                0.1%

X-Gluc    52 mg (事先用400μl DMSO助溶)  2mM
Add ddH2O    to 50 ml
注：X-Gluc 浓度范围较宽，最高可达10 mM，一般为2-5 mM，最常用2 mM。
Generally, concentrations of ferri/ferrocyanide between 0.5 and 5 mM each are used for most specimens, 1 mM being a good starting point.

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3楼2017-01-04 09:13:42

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