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【GUS染色】如何解决假阳性问题 已有2人参与
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| 我的材料是无菌播种的拟南芥幼苗，严格按照老师的方法做，可是WT与阳性苗的现象几乎一样，只是颜色淡些，请问大家有没有什么窍门可以避免幼嫩组织产生假阳性？ |
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2楼2017-01-03 20:30:54
lixg
铁杆木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
ShuiRn: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 谢谢 2017-03-02 20:53:46
ShuiRn: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 谢谢 2017-03-02 20:53:46
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以下是我们实验室的方法（提高K3[Fe(CN)6]和 K4[Fe(CN)6]的浓度；用冰预冷的90% 丙酮轻微固定降低内源---） GUS染色分析 参照 Sieburth和Meyerowitz (1997) 的报道并略有改动。 具体步骤如下：样品用冰预冷的90% 丙酮轻微固定（在冰浴中）10-15分钟，然后经缓冲液A（50 mM 磷酸缓冲液，pH 7.2，5 mM 铁氰化钾K3[Fe(CN)6]，5 mM亚铁氰化钾K4[Fe(CN)6]，0.5% Triton X-100）清洗数次。接着将样品投入GUS染色液(2 mM X-Gluc 溶解于缓冲液A中)，抽真空10分钟（冰浴中），37℃ 温浴2小时直至过夜（根据不同材料的染色程度而定）。染色后经系列乙醇脱水(30%乙醇、FAA固定、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、100%乙醇。每级乙醇30分钟—1小时，FAA固定1小时)。 脱水后的材料可直接用Hoyer’s透明剂（Liu and Meinke, 1998）透明、封片。为进行切片观察，一部分脱水后的材料经二甲苯透明、石蜡包埋（同一般的石蜡切片处理步骤）、切片、脱蜡、复水（100%、100%、95%、85%、70%、50%、30%、ddH2O，每级2-5分钟）、钌红衬染、脱水（30%、50%、70%、85%、95%、100%、100%乙醇，每级2-5分钟）、透明（1/2 100% 乙醇+1/2二甲苯、二甲苯、二甲苯，每级5分钟，）、中性树脂封片。 配方： 1. 缓冲液A： 50ml配方 终浓度 1M Na2HPO4 1.6 ml 1M KH2PO4 0.9 ml 50 mM NaKPO4 buffer pH7.2 0.1M K3[Fe(CN)6] 2.5 ml 5 mM 0.1M K4[Fe(CN)6] 2.5 ml 5 mM Triton X-100 0.05ml 0.1% Add ddH2O to 50 ml 2. GUS染色液： 50 ml配方 终浓度 1M Na2HPO4 1.6 ml 1M KH2PO4 0.9 ml 50 mM NaKPO4 buffer pH7.2 0.1M K3[Fe(CN)6] 2.5 ml 5 mM 0.1M K4[Fe(CN)6] 2.5 ml 5 mM Triton X-100 0.05ml 0.1% X-Gluc 52 mg (事先用400μl DMSO助溶) 2mM Add ddH2O to 50 ml 注：X-Gluc 浓度范围较宽，最高可达10 mM，一般为2-5 mM，最常用2 mM。 Generally, concentrations of ferri/ferrocyanide between 0.5 and 5 mM each are used for most specimens, 1 mM being a good starting point. |
3楼2017-01-04 09:13:42
Chegelhen
新虫 (初入文坛)
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- 帖子: 23
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- 虫号: 11123742
- 注册: 2018-11-02
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
4楼2018-11-06 15:42:23
