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中洪博元-TRIzol RNA提取方法
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（一）试剂准备 1．TRIzol试剂。 2．氯仿 3．异丙醇 4．75%乙醇（DEPC H2O配制） 5．DEPC H2O （二）操作步骤 1． 样品处理： （1）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。 （2）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min。 2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。 3．4℃离心，12000g×15min，取上清。 4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。 5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。 6．加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。 7. 晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）。 （三）注意事项 1．样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。 2．实验过程必须严格防止RNsae的污染。 二、总RNA定量 RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径，用 ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白 对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度： RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000 RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。 |
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