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1393075615木虫 (知名作家)
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[交流]
蛋白表达纯化 已有2人参与
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| 我是一名本科生，跟着老师们在做科研实验，前期将一个基因连接到PTYB12上（连上以后含有CBD标签不连空载也有CBD标签），菌液PCR一切正常，但是测序一直不正确，所以老师直接把序列给公司去做了，回来以后，将质粒转化进入感受态细胞，做菌液PCR条带大小正常，然后又酶切小片段也对，但转化进入rp感受态细胞以后不会长，所以换了表达菌株BL21细胞，长出了细胞，用LB培养，菌液PCR没问题，但是最后蛋白不表达，诱导条件，以及温度时间都摸索过，另外挂过柱子以后，空载可以纯化出来，但是连过基因的什么都没有，求解各位大神，该如何解决这个蛋白不表达问题。 |
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2楼2016-10-04 20:03:21
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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关于蛋白不表达的原因可以从多方面分析，你BL21菌株是原核表达，原核表达一般是比较容易做的，几点蛋白不表达原因分析 1）密码子优化问题，根据密码子的简并性可知换掉碱基序列氨基酸不变，所以根据自己表达系统（你这是原核）进行密码子优化，不同的表达系统有不同的密码子偏爱性； 2）mRNA结构优化，同样的mRNA结构没有优化会导致蛋白的错误折叠，表达的蛋白没有活性； 3）表达载体选择噶首台选择及表达条件优化：这一项设计的比较多，一般感受态多做几个，做个对比，还有的特定蛋白只能使用特定感受态才能做，条件设置不同的梯度，有可能你现在表达量低，你看不出来，IPTG浓度，降温表达都可以尝试。 具体的其他及相关解决方案可见文档：原核表达FAQ问题解决 |
3楼2016-10-27 14:12:43
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