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mRNA 在网织红细胞裂解液中的翻译
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从哺乳动物细胞中提取的 mRNA 或通过克隆化 DNA 在体外转录产生的 mRNA 在无细胞提取液中能被翻译而合成蛋白质,这些蛋白质可用于免疫沉淀试验或进行生物学活性测定。 实验材料 家兔 胰核糖核酸酶 小球菌核酸酶 I 型磷酸肌酸激酶 试剂、试剂盒 乙酰苯肼 溶液A 溶液B 灭菌重蒸水 CaCl2 EGTA 氯高铁血红素储存液 亚精胺 磷酸肌酸 氨基酸 DTT HEPES 水 KCl 乙酸镁 [35S] 甲硫氨酸 仪器、耗材 电泳装置 干酪包布 离心机 实验步骤 一、材料与设备 (一）兔网织红细胞裂解液的制备 1)2〜3 kg 的家兔 6 只。 2)1.2% 乙酰苯肼，用 1moL/LHEPES(pH7.0) 中和至 PH7.5。 3) 溶液 A:140 mmol/LNaCL,l.5 mmol/L 乙酸镁，5 mmol/LKCL,0.001% 肝素 4) 溶液 B:140 mmol/LNaCl,1.5 mmol/L 乙酸镁，5 mmol/LKC1 5) 灭菌重蒸水 6)lOOmmol/LCaCl2 7)200 mmol/LEGTA(pH7.0) 8) 小球菌核酸酶（150000 单位/ml), 保存于坫氨酸浓度为 50 mmol/L(pH9.2)，CaCl2 浓度为 5 mmol/L 的溶液屮 9)I 型磷酸肌酸激酶 40n^/ml，保存 50% 甘油中） 10) 氯高铁血红素储存液溶于乙二醇，浓度为 5 mg/ml), 氯卨铁血红素可按下法制备：在 400ul0.2mol/LKOH 中溶解氯高铁血红素（分子质暈为 652Da)，分多次缓慢添加，每次添加少量且各次之间应振荡；加入水 600ul, 加入 lmol/LTris-Cl(pH7.8),100ul, 滴加 0.1mol/LHC1 调节 pH 至 7.8; 加入 4.8 ml 乙二醇，振荡混合；4°C 以 5000 g 离心除去不溶性沉淀；用 lOmmol/LKCl 按 1:100 的比例稀释氯高铁血红素，读取 540nm 波长下的吸光度，推算其浓度（1 mmol/L 氯高铁血红素溶液吸光值为 11:1); 用比例为 4:1 的乙二醇：水溶液将氯高铁血红素的浓度调节至 5 mg/ml 11) 干酪包布。 12) 离心机。 (二）网织红细胞裂解液的翻译 1) 翻译反应混合液：按 K 法配制翻译反应混合液，分装为 50〜100ul/小份，储存于一 70℃ 或液氮中。 100 mmmol/L 亚精胺 200ul 800 mmol/L 磷酸肌酸 400ul 5 mmoi/L 氨基酸 (不合甲硫氨酸） 200ul lmol/LDTT 80ul 500 mmol/LHEPES(pH7.4) 1600ul 水 720ul 5 mm0l/L 氨基酸是含冇除甲硫氨酸外的所有氨基酸的溶液，浓度为 5 mmol/L。以 [35S] 甲硫氨酸对体外合成的蛋白质进行放射性标记时可使用这一溶液；如果以其他放射性标记氨基酸来标记蛋白质，则要使用相应的作标记氨基酸混合液。 2)lmol/LKCl 3)16.5 mmol/L 乙酸镁 4)T5S] 甲硫氨酸.8O uCi 100〜1200Ci/mmol/L，翻译级 5) 胰核糖核酸酶，l00 ug/ml 溶于 50 mmol/LEDTA(pH8.O) 6) 电泳装置。 二、操作方法 (一）兔网织红细胞裂解液的制备 1）挑选体重 2〜3 kg 的家兔 6 只，按以卜的程序皮下洼射乙酰苯肼溶液，以获得贫血家兔的血液。 第一天注射 2.0 ml 第二天注射 1.6 ml 第三大注射 1.2 ml 第四天注射 1.6 ml 第五天注射 2.0 ml 2) 在第七和第八天按以下方法采血：先用酒精棉球擦拭家兔耳朵，然后用一新刀片在耳长屮段的耳中静脉做一切口，每只家兔可采集 50 ml 血液，收集于 50 ml 冷却的溶液A 中。在第七和第八大取血量府适量，第九天可用戊巴比妥或芬太尼（fcntanyl) 麻醉动物 后作心脏穿刺放血（约吋采集 150 ml 血液，收集于 100 ml 溶液 A 中） 3) 干酪包布过滤血液，然后于 4℃ 以 2000 尺离心 5 min, 吸出由密度不均一的内细胞形成的宽沉积带的淡黄色的 H 细胞表层，用溶液 B 洗涤沉积的网织红细胞和红细胞 3 次，最后一次用 5000 g 进行离心。 4) 测量沉积细胞的体积，与等体积的预冷火菌双蒸水混合，于 0℃ 进行裂解，Imin 后再于 4℃ 以 20000 g 将裂解液离心 20 min。 5) 在 100 份的网织红细胞裂解液中加入 1 份氯高铁血红素和 2 份 CaCl2 溶液，混匀。 6) 加入 0.05 份小球繭核酸酶（150000 单位/ml)，混合后于 20℃ 温育 15 min, 然后置于冰水浴中冷却。 7) 加入 1 份 200 mmol/L 的 EGTA(pH7.0)，混句 8) 加入 0.4 汾磷酸肌酸激酶 (4 Gmg/ml), 混勻，把经过处理的细胞裂解液分装为 250〜500ul/小份, 保存于一 70℃ 或液氮中， (二）网织红细胞裂解液的翻译 1)RNA 或 mRNA 按前面章节所述方法可获得 2) 标准翻译反应系统组成如下： 翻泽反应混合液 2ul 1mol/LKCl 2ul 16.5 mmol/L 乙酸镁 1ul [32S] 甲硫氨酸 8ul 小球菌核酸酶处理的网织红细胞裂解液 10ul RNA 2ul 于 30℃ 温育 1 h。 3) 体外翻译反应产物 PT 通过免疫沉淀和 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 4) 进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳时，在现有的样品中加入 0.2 体积的胰核糖核酸酶，于-37℃ 温育 15 mm 以水解 [35S] 甲硫氨酸-tRNA。之后立即加入 2XSDS 凝胶加样缓冲液. 并煮沸样品，加样电泳。 5) 翻译反应产物中未使用的部分保存于-20℃ 注意事项 1) 网织红细胞裂解液的翻译活件取决于所加入的外源 mRNA。小球菌核酸酶在钙离子存在时有活性，加入 EGTA 后其消化活性丧失。因此，要确保网织红细胞裂解液中内源 mRNA 消化完全，以免翻译时产生杂带从而影响结果。 2) 氯高铁血红素是起始因子 cIF-2 抑制物的强阯遏剂，若缺少氯高铁血红素，网织红细胞裂解液经短时间温育后蛋白质合成就会停止。因此应在 20〜80umol/L 范围内对 K进行滴定，以取得最佳翻译条件。 3) 温和融化网织红细胞裂解液，未用完的裂解液尽快放回一 70℃ 或液氮中。 4) 翻译反应中乙酸镁的浓度依网织红细胞裂解液和 mRNA 的不同而小应在 0〜1 mmol/L 的浓度范围内对乙酸镁进行滴定，然耵选用最佳浓度的乙酸镁来确定不同浓度的氯化钾（20〜8OmmoI/L) 对特定目的 mRNA 的影 响。一般来说，大约 70mol/L 的 KC1 最适于带帽 mRNA 的翻译；而对于非带帽 mRNA, 其最适浓度是 40 mmol/L 左右。 5) 在反应系统中可加入多达 10ug 的总细胞质 RNA 或者 0.2ug 的 poly(A)+mRNA 或体外合成 RNA 至达到饱和。时使用poly(A)+mRNA 所得结果的背景要比使用细胞质 RNA 更小些 6) 在翻译系统中加入饱和量的 mRNA 可剌激 [35S] 甲硫氨酸在可用酸沉淀的物质屮的掺入量的增加，可增加到 10〜25 倍。在最佳条件下，25u1 反应混合物中约吋掺入 3X106〜5X106 计数/min(l〜3uCi) 的 [35S] 甲硫氧酸 7) 使用 10% 三氯乙酸（TCA) 沉淀放射忤标记蛋白前，应用 0.3moI/LNaOH 于 37°C 温育 15 min 或 5%〜10%TCA 在 100℃ 加热 15 min，以此处理反应液以破坏 [35S] 甲硫氨酸-tRNA。用 TCA 沉淀少量蛋白质后，可测出蛋白质屮 [35S] 甲硫氨酸的掺入量 8) 用 SDS 聚闪烯酰胺凝胶电泳分析网织红细胞裂解液时可能出现背景条带。时常出现的那些按表观分子质量为 45kDa 进行迁移的多肽得到 放射性标记，这一现象以及珠蛋白被标记的现象通常都是由硫氨酸中的杂质所引起的。对此问题，使用新购的放射性标甲硫氨酸一般可以避免 9) 双链 DNA 模板在体外转录时常产生一定量的双链 RNA, 它将抑制在网织红细胞中进行的翻泽。如果翻洋效率不高，则应尽量减少体外转录中双链 RNA 的量，同时将已知在网织红细胞中有活性的对照 RNA4 不同屢的体外转录系统中产牛的 RNA 相混合， 进行翻译试验。 |
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