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细胞周期测定实验
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实验目的 （1）作为生物相容性评价指标； （2）用于研究细胞凋亡； （3）作为选择细胞的依据。 实验方法原理 流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。 细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。 实验材料 HeLa细胞 试剂、试剂盒 乙醇、RNase-A、PI、PBS 仪器、耗材 流式细胞仪、细胞培养设备、离心机、水浴、冰箱、注射器、离心管、封口膜、微量移液器 实验步骤 一、取对数生长期细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，800 rpm，离心 15 min去上清。 二、PBS洗2次，加0.5 mL PBS吹匀，务必吹散。 三、用5 mL注射器将细胞吸起，用力打入5 mL 70%(预冷)乙醇中，封口膜封口。4℃固定过夜（可长至2周）。 四、800 rpm 15 min收集固定细胞，PBS洗2次。 五、用0.4 mL PBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打（防止细胞破碎）。 六、加RNase-A约3 μL至终浓度约为50 μg/mL ，37℃水浴消化30 min； 七、加PI约50 μL至终浓度约为65 μg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。 八、用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测。 九、样品分析测定及打印。 |
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