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PCR法检测乙肝病毒 已有1人参与
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多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种模拟天然DNA复制过程，在体外扩增特异性DNA（或RNA）片段的新技术。本实验是将待检双链DNA经94℃高温变性成单链作模板，然后加入一对人工合成的寡核苷酸引物，引物分别与待扩增DNA片段的两端互补，经55℃ 低温退火，引物与模板互补结合。在72℃条件下，结合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反应体系中的4种dNTP为原料，按碱基互补配对的方式延伸合成两条新的DNA链。所扩增的DNA可作为下一轮扩增反应的模板。重复上述循环过程，经过20～30个周期后，特异的目的DNA可扩增百万倍以上。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后即可观察到特异的扩增条带。 PCR方法操作简便，灵敏度高，可检测出少至0.1pg的目的DNA。目前已广泛应用于多种病原微生物的检测。 乙肝病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎，在我国发病率很高，而且HBV与肝硬化、原发性肝癌关系密切，因此，HBV的诊断极为重要。PCR检测HBV-DNA敏感性明显高于传统的血清学方法，且能显示HBV在体内复制情况，直接反映患者血液的感染性，并对模棱两可的或与临床表现不符的血清学结果，PCR技术有助于明确诊断。 一、材料 待检血清、HBV-PCR反应液20管（20μl/ 管）、HBV-DNA裂解液、阳性模板、溴化乙锭、PCR扩增仪、电泳仪、紫外线分析仪。 二、方法 1、标本处理： 取混匀的血清20μl加20μl裂解液，搅匀后100℃沸水浴10分钟，最后15000rpm/分钟离心3分钟，取4μl上清待检。 2、加样及PCR： 取反应液一管（使用前稍加离心），加4μl待检上清或阳性对照于底层反应液中，混匀后高速离心片刻，然后置94℃预变性2分钟，再按94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/60秒扩增35个循环。 3、电泳与结果判断： 取15μl 反应液，经2%琼脂糖凝胶电泳（5V/cm）30分钟后，在紫外灯下观察结果，若410bp处出现橙黄色带，则HBV为阳性。 三、注意事项 1、反应管中加好所有试剂后，应立即上机扩增，以免形成过多的二聚体。 2、阳性模板可用阳性血清代替，处理方法同上。 |
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| PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。我们实验室用BIODAI测得的扩增曲线起跳值一般在30左右，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。 |
2楼2020-03-17 13:14:08