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基因合成实验
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实验目的 获得一段特需列的最直接的方法就是化学合成。本方案是利用成对的寡核苷酸， 通过其3’端的退火而生成一短的双链区，寡核苷酸既作为模板，又起引物的作用，长达 400 bp 的所需片段通过一步反应即可合成。 实验材料 DNA 试剂、试剂盒 dNTP DAN聚合酶 乙醇 TE 限制性内切核酸酶缓冲液 仪器、耗材 水浴锅培养箱 实验步骤 1. 将两种寡核苷酸各1 μg加入微量离心管中，加水至17 μl，再加2 μl 的10×测序酶缓冲液。70℃加热5 min，然后在合适的退火温度下保温5 min，取2 μl 留待以后的分析。 2. 加2 μl 4种dNTP混合液和10 U测序酶，30℃温育30 min。 3. 70℃ 10 min 灭活DNA聚合酶，取2 μl 留待以后的分析。 4. 加10×限制性内切酶反应缓冲液，加水和20~100 U 的适合于克隆的限制性内切酶至100 μl。适当的温度下消化2 h 以上。 5. 酚抽提，加100 μl 4 mol/l 乙酸铵和400 μl 的无水乙醇，-70℃沉淀15 min，离心5 min，沉淀重悬于100 μl TE缓冲液，用乙醇再沉淀一次，用95%乙醇洗涤沉淀，干燥，20 μl TE缓冲液溶解，取2 μl 用于以后的分析。 6. 用筛分型琼脂糖凝胶电泳分析确证原材料、延伸产物和酶切产物，估计延伸的寡核苷酸的量，再用适当的载体亚克隆。 7. 对几个合适的亚克隆测序。 |
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