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huojinlong8610金虫 (小有名气)
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当前器官移植治疗疾病面临的最大问题是供体器官严重缺乏，器官衰竭患者多因无法及时得到供体器官而死亡。异种器官移植已成为目前科学界和医学界公认的解决供体器官短缺的有效途径，猪已被认为是最适合的非灵长类异种器官移植供体。猪→人异种器官移植的主要屏障是超急性排斥反应（HAR），α1,3半乳糖（α1,3Gal）是引起HAR的主要抗原，临床上将清除了α1,3Gal的猪器官移植给狒狒，仍会发生排斥反应，提示在猪体内还存在其他非α1,3Gal异种抗原。为了早日实现猪→人异种器官移植的临床应用，广大医学和科研工作者把目光转向了非α1,3Gal基因的挖掘和功能研究。本试验以独特的被誉为猪→人异种器官移植良好供体的BMI为研究材料，以与猪→人异种器官移植免疫排斥反应潜在相关的CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2等5个非α1,3Gal基因为候选基因，从分子、蛋白、细胞水平同时入手，验证这5个基因与猪→人异种器官移植免疫排斥反应的相关性。 首先从mRNA水平分离并获得这些基因的完全编码区序列信息，并对这些基因进行免疫相关多组织转录表达水平的qPCR检测分析，获得其在mRNA水平的表达情况；然后采用Western Blot方法进一步对相同组织进行验证，获得其在蛋白水平的表达情况；构建目的基因和绿色荧光报告基因GFP的融合表达载体，转染示踪进行细胞水平的验证；并对相关蛋白质进行基本信息、特征信息、结构域、功能位点、高级结构等功能生物信息学分析。 结果表明猪CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因的全长CDS序列分别为1734 bp、1590 bp、894 bp、861 bp、1509 bp，并提交到GenBank获得了认证。qPCR分析和Western Blot验证表明CMAH mRNA在颌下腺组织中表达最高；OXSR1 mRNA在睾丸中表达最高；CD80 mRNA在脾组织中表达最高；ASGR1 mRNA在肝脏中特异表达，在其它组织中不表达；B4GALNT2 mRNA在扁桃体中表达最高；揭示同一基因在不同组织和不同基因在相同组织中差异表达的现象，也说明基因主要在哪些组织发挥重要的功能，这些重要组织将是我们进一步研究该基因功能以及进行基因敲除和基因修饰研究的靶组织。构建了CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因和绿色荧光蛋白AcGFP1真核融合表达载体并将其转染猪肾上皮PK15细胞进行瞬时表达，均检测到了绿色荧光表达。在此基础上为了研究这些猪的基因与人免疫排斥反应的相关性，将这些真核融合表达载体转染人脐静脉内皮细胞HUVEC进行表达，均检测到了稳定表达的绿色荧光，表明CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因与猪→人异种器官免疫排斥反应相关。为这些基因在猪→人异种移植排斥反应中分子机制的阐明奠定了基础。 为深入了解基因编码的蛋白质的相关功能性质，我们对相应蛋白质进行了功能生物信息学分析，包括分析其氨基酸组成、分子式、分子量、等电点、消光系数、半衰期、原子组成、不稳定系数、脂肪指数、亲水系数等蛋白质基本信息；疏水性、跨膜结构、卷曲螺旋、信号肽、固有无序性、亮氨酸富集的核输出信号、亚细胞定位等蛋白质的特征信息；结构域和功能位点（磷酸化和糖基化）；二级结构和三级结构等。这些蛋白质的基本信息、特征信息、结构域、功能位点以及高级结构的生物信息学分析为CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2 5个蛋白质的进一步功能研究和验证提供了理论依据，也为下一步进行猪→人异种器官免疫排斥反应相关基因的联合敲除和基因修饰奠定了实验和临床试验基础。 本研究填补了CMAH、OXSR1、CD80、ASGR1和B4GALNT2基因在猪→人异种器官移植非超急性排斥反应α1,3Gal基因研究之外的空白，本研究结果不仅可为BMI猪→人异种器官移植利用提供基础数据资料，同时为促进其开发和利用提供科学依据，也可以为猪→人异种器官的早日实现奠定理论和实验基础。 |
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