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人滑膜细胞原代培养实验
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实验目的 人滑膜细胞原代培养可以：（1）细胞保种；（2）用于相应细胞生理、形态学研究；（3）用于相关疾病研究。 实验方法原理 将人滑膜从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置α-MEM生长培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。 实验材料：滑膜组织 试剂、试剂盒：Ⅰ型胶原酶胎牛血清生理盐水PBS 仪器、耗材：超净台、解剖剪、过滤网、离心管、记数板、培养瓶 实验步骤 一、实验材料准备 1. 滑膜组织：将外科手术切下的组织在手术台上请护士将标本放入低温生理盐水中，在手术完成时将标本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中带回实验室。 2. 试剂：4 mg/mlⅠ型胶原酶(α-MEM配制)，培养液(含10%胎牛血清的α-MEM)。 3. 器械：手术器械。 二、方法 1. 将切下的组织在手术台上请护士将标本放入低温生理盐水中(静止)，在手术完成时将标本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中带回实验室。 2. 在超净台中将标本放入培养皿中，加入α-MEM洗涤。 3. 获得组织切开，仔细辨认于关节反折处及增生的白色光滑的滑膜组织，附于关节软骨面的增生的血管翳也为滑膜组织(可作另一管消化)，仔细剔除脂肪组织，用α-MEM洗二次(以去除红细胞)，放在小青瓶中用解剖剪锐性切碎。 4. 用双倍获得组织的体积含有4 mg/mlⅠ型胶原酶的α-MEM消化37℃孵育120分钟(在此期间震动混匀数次)。 5. 30分钟后收集第一管细胞：细胞悬液经70 μm细胞滤网过滤，用1500-2000转离心6分钟，上清为Ⅰ型胶原酶加入未过滤网的组织，继续用于消化。 6. 离心管底细胞用α-MEM离心洗涤2次，每次用α-MEM重悬浮后用1500-2000转，离心6分钟，最后一次用记数板观察到有细胞。细胞最终悬浮于含有10%胎牛血清的α-MEM中，接种到培养瓶中培养。 7. 60钟后收集第二管细胞：细胞悬液经70 μm细胞滤网过滤，用1500-2000 rpm离心6分钟；用α-MEM洗2次，每次用α-MEM重悬浮后用1500-2000 rpm离心6分钟，最后一次用记数板观察细胞并计数。细胞最终悬浮于α-MEM含有10%胎牛血清中，接种到培养瓶中培养。 8. 必要时可做第三管细胞收集；并立即作原代滑膜细胞培养。 9. 每2-3天换液一次。 注意事项 1. 全培用α-MEM或RPMI1640或DMEM，加10%胎牛血清。不能用小牛血清，胎牛血清用国产即可； 2. 必须用Ca2+-free的PBS。 |
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