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原位杂交!很值得一看
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原位杂交 用特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行检测的方法称为核酸原位杂交(nucleic acid hybridizationin situ)。该技术最早应用于20世纪60年代末期。由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已广泛地应用于医学分子生物学研究。例如用标记的探针与分裂中期染色体DNA杂交以研究染色质中特定核酸序列在染色体中的精确定位；用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织与细胞进行杂交，以确定有无该病原体的感染等。原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。 核酸原位杂交包括组织细胞的固定、预杂交、杂交、冲洗及信号检测等基本步骤。 (一)组织或细胞的固定 原位杂交是在载玻片上进行的，因此进行原位杂交的第一步就是将组织或细胞固定在载玻片上。常用于核酸原位杂交的固定液有10％甲醛、4％多聚甲醛、乙醇：冰醋酸(3：1)、戊二醛、Garnoy固定液、Bouin固定液等。这些固定液都有不同的优缺点，因此要根据具体的实验对象选择最佳的固定液。 (二)组织细胞杂交前的预处理 固定到载玻片上的组织细胞中的核酸是与细胞内蛋白质结合在一起的，这种核酸蛋白质复合体会影响探针与核酸的结合，因此，降解核酸表面的蛋白质是杂交前预处理的关键。一般采用去垢剂和(或)蛋白酶对组织细胞进行部分性的消化，使探针在细胞基质中获得最大的穿透力。常用的去垢剂有TritonX—100和十二烷基磺酸钠(SDS)，常用的蛋白酶为蛋白酶K。所选用的蛋白酶中不能含有核酸酶；消化组织细胞的时间不能过长，否则会导致细胞结构破坏或使核酸从载玻片上脱落。 (三)探针的选择和标记 原位杂交中所用的探针可以是DNA探针、RNA探针、寡核苷酸探针等，一般标记的DNA或RNA探针的长度以50—300bp为好，这个长度的探针在组织细胞中的穿透力好。双链DNA探针是最常用的探针之一，但杂交时浓度高了易引起探针之间互补链的退火；用M1：克隆载体可制备单链cDNA探针，其最大的优点就是不会产生探针自身退火；人工合成的寡核苷酸分子量小，穿透力大，且可在基因序列的多部位设计探针以选择最佳序列；反义RNA探针是以DNA为模板转录出的RNA链，特异性强，不存在探针自身退火的问题。 用于原位核酸杂交的探针既可用核素标记，也可用非核素标记。核素标记的核酸探针敏感性高，但杂交信号的检测有时需要较长的时间，如3H标记的探针杂交曝光时间需要数周或数月。与放射性核素标记的探针相比，非放射性探针具有安全、无放射性污染、稳定性好、显色快而易于观察等优点，近年来得到了广泛的应用。 (四)杂交 原位杂交在载玻片上进行，杂交液的体积应尽量小，一般每张切片用10～20／11杂交液。cDNA和RNA探针的杂交温度大约为50℃。DNA探针的杂交可在2—4h内完成，而RNA探针的杂交则应过夜。如果靶分子是细胞内的DNA，应将组织切片加热至95℃5—15min，使靶DNA变性。杂交后的冲洗温度一般不高于50℃，以免使组织细胞结构破坏或脱落。用反义RNA探针杂交时，杂交后用RNA酶消化单链RNA以降低本底。 (五)杂交结果检测 若原位杂交应用的是放射性核素标记探针，杂交后必须经过放射自显影，对被检测的核酸进行定位与定量；若应用的是非放射性标记的探针，则根据标记体系对杂交结果进行检测，例如生物素标记的探针检测主要用抗生物素抗体和亲和素检测。 |
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