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Hey Daring

新虫 (正式写手)

[求助] 求助 麻烦点进来看看 已有2人参与

需要做荧光定量验证 所以需要内参 但是这个物种之前没人做过分子方面的分析 做完转录组测序后 分析得出三个可能作为内参的序列 然后合成引物 看看是否能扩增出来 问题是 第一次PCR以后 有所需条带 第二次直到现在做的话 没有任何条带 换了引物也不行 过程中的操作很严格 试剂也没问题 求大神帮忙解答 假如自身没有序列可以作为内参(相近的种属也没类似研究) 如何找到可用内参 拜托

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1楼 2016-09-02 19:30:17
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-03 08:11:02
可以看看相关文献，一般都是用tublin、actin、18s rDNA、UBQ等常见管家基因，从你这个物种转录组里挑出相关基因，先扩全长序列，然后根据测序结果再设计定量引物。
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2楼2016-09-03 01:52:45
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世间妙音

铁虫 (初入文坛)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-03 08:11:07
祝好运

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千江有水千江月，万里无云万里天
3楼2016-09-03 06:29:32
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Hey Daring

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2016-09-03 01:52:45
可以看看相关文献，一般都是用tublin、actin、18s rDNA、UBQ等常见管家基因，从你这个物种转录组里挑出相关基因，先扩全长序列，然后根据测序结果再设计定量引物。

之前挑出三个可以作为内参的后备序列，然后连接载体，摇菌送去测序，发现跟我的序列同源性很低，想再重复一次或者换引物试一次的时候就P不出来了。如果我用别的物种的内参，我是不是还需要验证下那个内参在我这是否存在或者可以稳定表达？

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4楼2016-09-04 10:54:11
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by Hey Daring at 2016-09-04 10:54:11
之前挑出三个可以作为内参的后备序列，然后连接载体，摇菌送去测序，发现跟我的序列同源性很低，想再重复一次或者换引物试一次的时候就P不出来了。如果我用别的物种的内参，我是不是还需要验证下那个内参在我这是否 ...

你连到载体上的序列与你序列相似性低，意思就是与你转录组里的序列比相似性低吧？那到底是不是你需要的目标序列呢？相似性是多少？如果是一个非特异扩增，那需要参考其他物种重新设计引物。如果确定是你的目标序列，那就根据你的测序结果重新设计引物。用别的物种内参是需要先验证是否存在和是否能稳定表达的。
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5楼2016-09-04 14:02:00
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Hey Daring

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by stone2239 at 2016-09-04 14:02:00
你连到载体上的序列与你序列相似性低，意思就是与你转录组里的序列比相似性低吧？那到底是不是你需要的目标序列呢？相似性是多少？如果是一个非特异扩增，那需要参考其他物种重新设计引物。如果确定是你的目标序列 ...

嗯 送去测序以后 跟我可能作为内参的序列进行序列比对 相似性30％左右 如果我的物种自己的序列没有合适的 可以用作内参的话 我就需要使用别的物种 麻烦请教您 如何确定别的物种的内参在我这存在以及稳定表达

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6楼2016-09-04 23:17:08
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

是否方便告知你研究的物种是什么啊？不应该没有内参基因吧？任何物种肯定有house-keeping基因的
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坚持到底就是胜利！
7楼2016-09-08 10:59:43
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Hey Daring

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by kuaile5420 at 2016-09-08 10:59:43
是否方便告知你研究的物种是什么啊？不应该没有内参基因吧？任何物种肯定有house-keeping基因的

不好意思，之前帖子出现问题没及时回复，材料是植物，东方香蒲，确实没人做，不过内参现已找到，谢谢

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8楼2017-02-13 00:25:13
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