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[交流]
真菌菌丝的总RNA的提取
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试剂： RNA提取缓冲液（CTAB）：2% CTAB（W/V），2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V），100 mM Tris-HCl（pH8.0,DEPC处理的水配置），25mM EDTA, 0.5g/L 亚精胺Spermidine，2.0M NaCl，2%巯基乙醇（V/V，使用前加入）。由于在高温灭菌条件下，Tris-HCl要和DEPC发生反应，所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC 处理的水配制即可。 SSTE：1 M NaCl，0.5% SDS（W/V），10 mM Tris-HCl pH8.0，1.0 mM EDTA 10M LiCl 直接用蒸馏水配10M LiCl，加1‰的DEPC过夜后，高温灭菌。 3M NaAc 氯仿:异戊醇（24:1） 酚（pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1） DEPC处理水 用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜，高温灭菌 无水乙醇 70%酒精 方法 1. 实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热，离心管中加入ME（巯基乙醇）（10mL加80ul，50mL中加入300ul）。 2.取约0.8g菌丝体（液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了），在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50 mL离心管，按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液，颠倒混匀。 3. 65℃水浴3-10 min，期间混匀2-3次 4. 加入等体积的酚（注意是酸酚pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提（10,000 rpm，4℃，5 min） 5. 取上清，等体积的氯仿:异戊醇（24:1）抽提（10,000 rpm，4℃，5 min） 6. 加入1/4V体积10M LiCl溶液，4℃放置6hr以上(或过夜) 7. 10,000 rpm，4℃离心20 min 8. 弃上清，用500 ulSSTE溶解沉淀 9. 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提两次，氯仿:异戊醇（24:1）抽提1次（10,000 rpm，4℃，5 min） 10. 加2V体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30 min以上 11. 12,000 rpm，4℃离心20 min 12. 弃上清。沉淀用70%酒精漂洗一次，干燥 13. 加200 ul的DEPC处理水溶解 14. 用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量 （在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数） 注意：提取RNA请尽量在低温下操作，如果条件不容许，在室温下操作的时间要尽可能的短。 |
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