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铁蛋白免疫电镜技术 已有1人参与
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一、 原理 免疫铁蛋白技术是以铁蛋白标记抗体，再以铁蛋白抗体与待检抗原作用。通过电镜检查，观察到铁蛋白抗体所在的位置，即抗原所在。 二、材料与试剂 1．马脾铁蛋白 2．硫酸铵 3．硫酸镉 4．双异氰酸镉二甲苯(Metaxylene dlisocyante XC)以0.30Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将XC配制成1%溶液。注意配制的水及容器必须特别清洁，配制后放置4℃数天，以不出现沉淀为准。如出现沉淀XC的多聚体形成，应重配。 5．0.30Mol/L pH 9.5硼盐酸缓冲液 6．0.1Mol/L硫酸铵液 7．0.05Mol/L pH 7.4 PBS液 三、操作方法 1．铁蛋白的提取 ① 配制2%硫酸铵液，并以1Mol/L的NaOH或HCl调pH值，正好为5.85。取1g铁蛋白溶于100ml的2%硫酸铵液中。 ② 加入20%硫酸镉，使最终浓度为5%，混匀，4℃过夜。 ③ 1 500g离心(4℃)2h，去上清。仍加2%硫酸铵至100ml，混匀，离心，去除不纯沉渣。 ④ 于上清液中重新加入20%硫酸镉，重复步骤⑵，离心，去上清。 ⑤ 检查沉渣，置显微镜下检查，应具有典型的黄褐色结晶，结晶为六角形，双一四点结构，如结晶不典型，应继续重复以上步骤。 ⑥ 以少量的蒸馏水溶解，再加50%饱和硫酸铵溶液，使之沉淀，离心，去上清。 ⑦ 重复步骤⑹一次。 ⑧ 以少量蒸馏水溶解,常水透析24h后,以0.05Mol/L pH 7.5PBS透析24h。 ⑨ 100 000r/min离心2h，去除上部无色上清液(约3/4总量)，置4℃过夜。 ⑽ 用微孔滤膜(孔径0.45μ)过滤，使铁蛋白含量为65mg/ml～75mg/ml，分装，4℃保存不要冻干保存,以免铁蛋白结构遭破坏。 2．铁蛋白－抗体交联法 ① 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将铁蛋白稀释成20mg/ml～25mg/ml。 ② 以1︰1000(W/W)的比例加入XC液室温搅拌45min，离心去沉淀。 ③ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将提纯lgG配成5mg/ml，以1︰4的比例(V/V)加入IgG与铁蛋白－XC液，4℃搅拌48h。 ④ 以0.1Mol/L碳酸铵溶液透析过夜，以除去多余的异氰酸盐，再以0.05Mol/l pH 7.5 PBS透析，使pH值恢复到生理水平。 ⑤ 超速离心 以1.00×105g离心5h，去上清，沉淀以0.05Mol/L PBS悬浮，再次离心，以除去未结合的IgG。 ⑥ 以血清学及免疫学方法测定结合抗体的特异性、免疫活性以及标记效应，如果操作步骤严格，结果是满意的。 3．铁蛋白－抗体结合物处理标本 ① 将标本以5%福尔马林pH 7.2(4℃)PBS液固定40min～60min。 ② 用冷的PBS液洗涤，离心。 ③ 如是组织块，则在解剖显微镜下切成更小块，放入试管中，加入铁蛋白－抗体结合物置室温20min，不时振荡, ④ 以冷PBS液洗涤三次，离心。 ⑤ 沉淀以2.5%戊二醛固定20min，以PBS洗涤。 ⑥ 再以锇酸固定，脱水包埋。 也可以先超薄切片，再进行铁蛋白－抗体结合物染色。操作如下： ① 将培养细胞以1%福尔马林PBS液固定(4℃)。 ② PBS液洗涤离心。 ③ 以0.5ml,30%牛血清蛋白PBS液悬浮置入胶透析膜袋中，再将袋置于吸水剂粉末上，待牛血清白蛋白成胶状物时，将透析袋移至2%戊二醛PBS液（pH7.5）中固定3h。 ④ 取出，切成小块，以PBS液洗涤。 ⑤ 置干燥器中以硅胶干燥。 ⑥ 包埋、切片、在水上收集切片置于经4%牛血清白蛋白PBS液处理的披有胶膜的载网上(牛血清白蛋白的处理在于减少铁蛋白结合物非特异性吸附于载网上)。 ⑦ 滴一滴铁蛋白－抗体结合物于载网上。 ⑧ 5min后，浮网于PBS液面,标本面向下，以除去多余的结合物。 ⑨凉干后，滴一滴乙酸双氧铀或氢氧化铅以复染。水洗、晾干、电镜观察。 四、结果判定 在已知对照样品成立的前提下，凡是出现黑色的铁分子颗粒即表示http://www.chinazhby.com/的存在，判定阳性(＋)，否则判为阴性(－) |
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