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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 带有酶切位点的引物，TM值怎么设置啊？
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6491333

铁虫 (小有名气)

[交流] 带有酶切位点的引物，TM值怎么设置啊？

我的引物加了酶切位点是分别是68，66，65，66度。而原引物是50，52，54度左右！这扩片段是该怎么考虑设计反应TM值？？？

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怪我咯|本人是用生命唱歌的歌手一名!
1楼 2016-08-22 11:24:05
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781055707

木虫 (著名写手)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-08-22 22:43:36
xn8008: 应助指数+1 2016-08-23 08:03:04
以原引物是50，52，54度左右为准，引物的退火温度以结合模板DNA的碱基计算为准。
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采菊东篱下，悠然见南山。
2楼2016-08-22 11:27:54
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
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3楼: Originally posted by 6491333 at 2016-08-22 11:53:48
那循环过后，产物会带着酶切位点，是不是需要换成加了酶切位点引物的TM值呢？我好苦恼
...

不用纠结，就用原引物的Tm值，至于若干循环后是否需要提高退火温度，没有必要，能扩出来就行，放心做吧。
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4楼2016-08-22 15:09:02
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781055707

木虫 (著名写手)
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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-23 08:03:31
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3楼: Originally posted by 6491333 at 2016-08-22 11:53:48
那循环过后，产物会带着酶切位点，是不是需要换成加了酶切位点引物的TM值呢？我好苦恼
...

它在从退火到延伸有个从55度到72的过程。
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6491333
采菊东篱下，悠然见南山。
6楼2016-08-22 16:17:24
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6491333

铁虫 (小有名气)
送红花一朵
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6楼: Originally posted by 781055707 at 2016-08-22 16:17:24
它在从退火到延伸有个从55度到72的过程。...

对哈！哈哈，我扩出来了！！

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怪我咯|本人是用生命唱歌的歌手一名!
7楼2016-08-22 20:10:32
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luckydog52

木虫 (著名写手)
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12楼: Originally posted by 6491333 at 2016-08-25 13:13:54
做了梯度，扩的也亮
...

那就不要纠结那个tm最优, 抓紧时间做后续的试验。
时间紧迫不要浪费时间在这些小试验上

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自信源于一次次成功的积累
13楼2016-08-25 13:38:08
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普通回帖

6491333

铁虫 (小有名气)
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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-23 08:03:11
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2楼: Originally posted by 781055707 at 2016-08-22 11:27:54
以原引物是50，52，54度左右为准，引物的退火温度以结合模板DNA的碱基计算为准。

那循环过后，产物会带着酶切位点，是不是需要换成加了酶切位点引物的TM值呢？我好苦恼

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怪我咯|本人是用生命唱歌的歌手一名!
3楼2016-08-22 11:53:48
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lisu555
5楼2016-08-22 15:22:46
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waterzjf

新虫 (小有名气)
★
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前两个循环按不带酶切序列的tm计算，后面就算上带酶切序列的tm

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8楼2016-08-24 13:13:27
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wer342342
9楼2016-08-24 16:50:11
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6491333

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by waterzjf at 2016-08-24 13:13:27
前两个循环按不带酶切序列的tm计算，后面就算上带酶切序列的tm

也对

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怪我咯|本人是用生命唱歌的歌手一名!
10楼2016-08-24 18:50:34
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