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活体动物光学成像技术在中医药研究中的应用展望
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活体动物光学成像技术在中医药研究中的应用展望 活体动物体内光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记。利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过这个系统，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。传统的动物实验方法需要在不同的时间点宰杀实验动物以获得数据, 得到多个时间点的实验结果。相比之下，可见光体内成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录，跟踪同一观察目标（标记细胞及基因）的移动及变化，所得的数据更加真实可信。另外, 这一技术对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高，不涉及放射性物质和方法, 非常安全。 因其操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高等特点, 在刚刚发展起来的几年时间内，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。 一、 技术原理 1. 标记原理 哺乳动物生物发光，是将Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP及氧气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。对于细菌，lux操纵子由编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成，带有这种操纵子的细菌会持续发光，不需要外源性底物。 基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。标记细胞的方法基本上是通过分子生物学克隆技术, 将荧光素酶的基因插到预期观察的细胞的染色体内，通过单克隆细胞技术的筛选, 培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。目前, 常用的细胞株基本上都已标记好, 市场上已有销售。 将标记好的细胞注入小鼠体内后, 观测前需要注射荧光素酶的底物—荧光素，为约280道尔顿的小分子。荧光素脂溶性非常好, 很容易透过血脑屏障。注射一次荧光素能保持小鼠体内荧光素酶标记的细胞发光30-45分钟。每次荧光素酶催化反应只产生一个光子，这是肉眼无法观察到的，应用一个高度灵敏的制冷CCD相机及特别设计的成像暗箱和成像软件，可观测并记录到这些光子。 2. 光学原理 光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。在偏红光区域, 大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。利用灵敏的活体成像系统最少可以看到皮下的500个细胞，当然，由于发光源在老鼠体内深度的不同可看到的最少细胞数是不同的。在相同的深度情况下, 检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系。可见光体内成像技术的基本原理在于光可以穿透实验动物的组织并且可由仪器量化检测到的光强度，同时反映出细胞的数量。 3. 实验过程 通过分子生物学克隆技术, 应用单克隆细胞技术的筛选，将荧光素酶的基因稳定整合到预期观察的细胞的染色体内，培养出能稳定表达荧光素酶蛋白的细胞株。典型的成像过程是：小鼠经过麻醉系统被麻醉后放入成像暗箱平台，软件控制平台的升降到一个合适的视野，自动开启照明灯拍摄第一次背景图。下一步，自动关闭照明灯, 在没有外界光源的条件下拍摄由小鼠体内发出的光，即为生物发光成像。 与第一次的背景图叠加后可以清楚的显示动物体内光源的位置，完成成像操作。之后，软件完成图像分析过程。使用者可以方便的选取感兴趣的区域进行测量和数据处理及保存工作。当选定需要测量的区域后，软件可以计算出此区域发出的光子数，获得实验数据。软件的数据处理和保存功能非常强大，可以加快实验速度，方便大批量的实验。 4．荧光成像功能 荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态，而后产生发射光。常用的有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白DsRed 及其它荧光报告基团，标记方法与体外荧光成像相似。荧光成像具有费用低廉和操作简单等优点。 同生物发光在动物体内的穿透性相似，红光的穿透性在体内比蓝绿光的穿透性要好得多，近红外荧光为观测生理指标的最佳选择。 虽然荧光信号远远强于生物发光，但非特异性荧光产生的背景噪音使其信噪比远远低于生物发光。虽然许多公司采用不同的技术分离背景光，但是受到荧光特性的限制，很难完全消除背景噪音。这些背景噪音造成荧光成像的灵敏度较低。目前大部分高水平的文章还是应用生物发光的方法来研究活体动物体内成像。但是，荧光成像有其方便，便宜，直观，标记靶点多样和易于被大多数研究人员接受的优点，在一些植物分子生物学研究和观察小分子体内代谢方面也得到应用。对于不同的研究，可根据两者的特点以及实验要求，选择合适的方法。最近许多文献报道的实验中，利用绿色荧光蛋白和荧光素酶对细胞或动物进行双重标记，用成熟的荧光成像技术进行体外检测，进行分子生物学和细胞生物学研究；然后利用生物发光技术进行动物体内检测， 进行活体动物体内研究。 二、 技术应用 通过活体动物体内成像系统，可以观测到癌症的发展进程以及中药（单体或复方）治疗所产生的反应，并可用于构建转基因动物疾病模型，观测治疗炎症等的中药治疗效果。具体应用如下： 1.中草药抗肿瘤疗效观察 应用活体动物体内光学成像技术可以直接快速地测量各种癌症模型中肿瘤的生长和转移，并可对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估。活体生物发光成像能够无创伤地定量检测小鼠整体的原位瘤、转移瘤及自发瘤。生物发光成像技术提高了检测的灵敏度，即使微小的转移灶也能被检测到（可以检测到体内102个细胞的微转移）。 为研究目的基因是在何时、何种刺激下表达，将荧光素酶基因插入目的基因启动子的下游，并稳定整合于实验动物染色体中，形成转基因动物模型。利用其表达产生的荧光素酶与底物作用产生生物发光，反应目的基因的表达情况，从而实现对目的基因的研究。可用于观察中药诱导特定基因表达或关闭。 研究者根据研究目的，将靶基因、靶细胞、病毒及细菌进行荧光素酶标记，同时转入动物体内形成所需的疾病模型，包括肿瘤、免疫系统疾病、感染疾病等等。可提供靶基因在体内的实时表达和对候选药物的准确反应，还可以用来评估候选中药和其它化合物的毒性。为中药在疾病中的作用机制及效用提供研究方法。 中药现代研究存在的问题： （1）单体与复方：现在大家研究中药动辄就分离单体，鉴定结构，然后用一些需要样品量很少的体外模型。然而通过天然药物化学手段分离出来的成分（尤其是单体）含量极少，成本很高，往往不能满足药效评价的药量，简单的体外筛选由于药物本身的理化性质、体内代谢的不同与体内用药差别很大，也有点偏离里中医药的整体思想，未能充分重视中医药的传统经验。传统中药很少单用，多为组方用药，中药的疗效主要是方剂的药效。中药(尤其是复方)的整体性作用机制和疗效在系统代谢组学的研究方法下将可能得到充分的展示和“挖掘”。寻找疾病的多靶点治疗方式：以"靶点"为基础的复方研究应当加强。复方中药运用中医阴阳平衡理论、藏象学说和扶正祛邪等理论，合理配伍，从整体上治疗许多疑难疾病。 （2）吸收现代科学的精华，用现代科学语言阐释中医药理论与疗效的本质：传统中药的作用机理都是根据中医基础理论中的精气神、五行等理论来解释的，在许多方面都是很有道理的，但是中药要现代化，要面向世界的话，就得在某些地方与国际医药卫生的标准接轨。所以中药现代化应重视中药化学组学和中药基因组学，将生物芯片、活体成像等为核心的技术引入到现代中药研究中去。 正如前面所说，由于中药的成分非常的复杂，各种成分的药理和相互作用不明确，这样很难让外国人接受，因为他们盛行的是合成药，是一种有效成分，或者仅仅是几种成分，做过西药液相或者处方筛选的战友都知道西药处方中无非就是主药、几种辅料混合在一起，使得主药既能够达到药理作用，刚刚好在治疗窗之内，又要保证药物的溶出（主要针对固体制剂，如片剂、胶囊等；液体制剂除外）。 （3）中药临床前研究：建立中药药动学，拥有自己的一套能够让人家心服口服的标准是当务之急，这对于中药的现代化也许是一个里程碑。 加大给药系统的研究。围绕提高药物的生物利用度、平稳的血药浓度和优良的药物代谢参数、给药的靶向性三个方面去努力，最终达到以最小剂量的给药达到治疗效果，以回避可能产生的毒副作用。 应用举例：喜树碱治疗肿瘤的疗效观察 Preclinical Efficacy of the Camptothecin-Polymer Conjugate IT-101inMultiple Cancer Models Clin Cancer Res 12(5),1606-1614,March 1, 2006 Fig. 5. Antitumor effect of irinotecan at100 mg/kg (top) and IT-101at12.5 mg/kg CPTequivalents (bottom) in a disseminatedTC71-luc tumormodel (Ewing’s sarcoma) in nonobese diabetic/severe-combined immunodeficient mice.Tumor burden as a function of time (in days) was monitored using a Xenogen imaging system. Arrows, treatment n days 0, 7, and 14. Color bar, lighti ntensity emitted in photons per second. 应用活体成像技术进行中药的疗效观察的优势在于： 从动物水平进行了疗效观察，避免由于体内微环境不同而导致的疗效差别。这也符合中医整体观念的特点，与其不某而合。 适用于中药复方的研究，通过结果来判断药物的疗效，给予充分的证据。 中药药物动力学模型的探索。 中药配伍的优化。通过给予不同的配伍，利用活体成像的优势，方便的观察不同配伍的复方的疗效差别。 中药剂量、服药时间、剂型的优化 2. 中医机理研究：标记某基因，观察与某些中医证侯的相关性表达，从基因水平研究中医“证”的本质。 藏象学说是中医药基础理论的核心，辩证论治是中医学治疗疾病的核心思想。围绕着中医“证”本质，近年来从现代科学的角度，用分子生物学的相关手段，从分子水平进行了大量的研究。中医的“证”是辨证论治的起点和核心，辨证综合了产生病变的各方面(包括当时的气候和环境情况)因素和条件，并结合个体体质、疾病发生的不同阶段和表现，判定为不同的证，从而采用不同治法，通过合理配伍、适时调整药量而达到治疗效果。由此，可以认为“证”的研究能与处于科学前沿、综合程度很强的系统生物学方法相结合，同时也是生命科学和临床医学的结合。这将把“证”的研究再次推向科学发展的前沿，成为中医现代化最重要的研究方向之一。最近兴起的系统生物学，将把系统论的精华、中医学辩证论治的研究有机的结合，互相取长补短，相互渗透，充分运用中医学整体观念的哲学智慧，把生命科学的研究推向一个新的高度。 通过转基因小鼠，可以方便的观察中医各种证侯对相关基因表达的影响，观察药物对于相应证侯的治疗效果。如果从基因表达水平证明证的本质，找出肾阴虚等的特异性基因，从基因水平阐释不同体质个体的差异，那将极大地促进中医药现代化的步伐。 联系人：万春丽 021-68569108 13651886549 （上海） 电子邮件：invivoimaging@aliyun.com |
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