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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 镍柱纯化后，酶活性极低，怎么回事？
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一只毛毛虫

新虫 (初入文坛)
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镍柱纯化后，酶活性极低，怎么回事？
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本人用镍柱纯化蛋白后，跑SDS发现蛋白浓度比破壁上清中的高了很多，但是测酶活很低，你上清低了好几倍。
首先缓冲液是ph7，4摄氏度放置了一夜。
请大神解示下，到底怎么回事？

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1楼 2016-08-13 09:42:57
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qw2014

新虫 (初入文坛)
★
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应该是降解了，活性蛋白纯化最好是当天破壁当天纯化，破壁纯化过程添加1mMPMSF，纯化后立即加EDTA，全程低温操作。还不行的话那你这蛋白太不稳定了，得优化其他如缓冲液等条件
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14楼2016-08-19 11:48:49
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)
★
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洗脱用的咪唑除掉了吗？会影响活性的。

当然也可以比较原来的上清与过柱以后的上清活性是否相差很多。也许你看到的活性不是来源于你的蛋白呢。

如果你确定了挂柱以后上去活性就减少了，而且咪唑也除掉了，那估计是你纯化以后的蛋白丢掉了某些重要的辅因子，你需要补足。注意可能是金属离子哦。
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12楼2016-08-13 11:16:31
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shadow_liu

新虫 (初入文坛)
★
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有可能是酶最适合条件变化了，之前在上清内，有合适的酶ph值，还有辅酶，甚至有的酶是协同作用，提纯了活性降低，加点BSA与金属离子再试试，或者看一下文献，是否有你提纯的酶结构活性的报道，查找一下具体原因
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13楼2016-08-15 09:09:37
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7658244282楼
2016-08-13 09:43   回复  
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秋后蚂蚱7楼
2016-08-13 09:43   回复  
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yanziluoye5楼
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woodwest23楼
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张小生子9楼
2016-08-13 09:43   回复  
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mql199211楼
2016-08-13 09:43   回复  
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梅拉多宁6楼
2016-08-13 09:43   回复  
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nice24864楼
2016-08-13 09:43   回复  
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445411310楼
2016-08-13 09:43   回复  
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heimawangzi28楼
2016-08-13 09:43   回复  
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