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anyeout新虫 (初入文坛)
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真菌PKS NPRS基因筛选 已有2人参与
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| 本人是做微生物天然产物的新手，发现文献中有很多关于放线菌中PKS、NPRS基因的筛选，但是有关真菌PKS、NPRS的筛选很少，想请问各位虫友，可否用PCR方法对真菌中这两种基因进行筛选？引物是什么？放线菌和真菌中编码这两种酶的基因一样吗？ |
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caozhichun
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2楼2016-08-15 11:45:54
anyeout
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starybirds
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【答案】应助回帖
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上网给你找的，基因筛选的方法： 1、从基因文库中获得目的基因. 方法： 第一步,通过PCR方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来,进行放射性同位素标记（也可以用别的标记方法进行,如生物素、荧光素等）,即用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针,与扩增出来的DNA杂交. 第二步,将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜上（也可以用其他类型的膜）,然后,通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质,并使DNA固定在膜上. 第三步,按Southern杂交的方法进行杂交. 第四步,在X光底片上出现黑斑的菌落,这表明这个菌落中含有所需要的目的基因（若选用别的标记方法,有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基因）. 第五步,从该菌落中再提取目的基因. 2、PCR 筛选法方法： 第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90～95 ℃,使双链DNA模板两条链之间的氢键打开,变成单链DNA,作为互补链聚合反应的模板. 第二步：将反应体系降温至55～60 ℃,使两种引物分别与模板DNA链3′端的互补序列互补配对,这个过程称为复性. 第三步：将反应体系升温至70～75 ℃,在耐高温的DNA聚合酶催化作用下,将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上,使DNA链延伸,产生一条与模板链互补的DNA链. 上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了两个DNA分子,随着重复次数的增多,DNA分子就以2n的形式增加.PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的. 3、核酸杂交法、 DNA和DNA分子之间的杂交.目的基因是否整合到受体生物的染色体DNA中,这在真核生物中是目的基因可否稳定存在和遗传的关键.如何证明这一点,就需要通过Southern杂交技术.基本做法是： 第一步,将受体生物DNA提取出来,经过适当的酶切后,走琼脂糖凝胶电泳,将不同大小的片段分开； 第二步,将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上； 第三步,用标记了放射性同位素（或生物素）的目的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交； 第四步,将X光底片压在硝酸纤维素膜上,在暗处使底片感光； 第五步,将X光底片冲洗,如果在底片上出现黑色条带,则表明受体植物染色体DNA上有目的基因. 4、免疫筛选法 Western杂交──蛋白质分子（抗原—抗体）之间的杂交.它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法.具体做法是： 第一步,将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质； 第二步,将表达出的蛋白质注射动物进行免疫,产生相应的抗体,并提取出抗体（一抗）； 第三步,从转基因生物中提取蛋白质,走凝胶电泳； 第四步,将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上； 第五步,将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交,这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合.由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带,所以加入一种称为二抗的抗体,它可以与一抗结合,二抗抗体上带有特殊的标记.如果目的基因表达出了蛋白质,则结果为阳性. |
4楼2016-08-18 20:36:17
