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【整理总结】MTT实验心得 已有10人参与
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MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也常常用来检测细胞的增殖情况。MTT的原理：活细胞有琥珀酸脱氢酶，将MTT还原成棕褐色沉淀。由于一般介绍园子里已经很多，笔者将自己的心得按照实验流程与大家交流交流。 1、培养好细胞点板。 养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法。如果知道了细胞的名字，就可以上www.atcc.org检索细胞的培养信息，这个网站上的培养方法是标准培养方法。当然可以根据自己实验要求进行修改。由于细胞计数很繁琐，点板时的细胞浓度是最难掌握的，这一点笔者的心得如下：自己先将细胞养一段时间，大概了解细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况。这时可以将细胞不进行计数，将消化好的细胞混匀后（可能是10 ml）直接在一个废弃（最好进行过无菌处理）的96孔板中依次加入180、100、50微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到板底了，这时在显微镜下观察，推测哪个孔的细胞48 h能基本长满板底，假设50 微升的孔比较合适，而点板时没孔需点200 微升，那么就将细胞浓度再稀释4倍就可以正式点板了，这时顺便将细胞进行计数（因为实验记录要求写啊）。这样就OK了！如果细胞还太多，将细胞稀释4倍后再重复以上操作。注意：不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于颗粒的分布不均匀，代表性是很差的。建议：细胞计数一定要会，但不要完全依赖它。点板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD会狂大。 2、点板布局。 其实这一点很多人不懈一顾。如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边缘效应”这些孔的SD也会狂大，既然如此，不如不用。 3、加MTT。 如果确认你考察的药物没有氧化还原性，你可以直接加入MTT溶液（总体积的1/10），如果你没有把握，建议在加MTT前换一次液；如果你肯定考察的药物的氧化还原性很强，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是你不需要的。 4、加入MTT后的反应。 时间为3-4h，此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO。为了将沉淀溶解完全，尽可能将水弃除干净，加入DMSO后在摇床上震摇10min。提醒：如果你的细胞贴壁不好，此时的沉淀在弃去液体时易丢失，因此贴壁不好的细胞在点板时记得将96孔板用多聚赖氨酸处理处理，要么在弃液体时先用甩板机离心，再轻轻弃去液体。关于DMSO的量，每孔的体积有点儿差异不干扰检测，只要能将沉淀完全溶解就行了。至于DMSO的体积差异不同为什么不影响检测值已经被数学证明了，在此我不多说，如果有人不明白我再证明给他看。当然为了养成良好的实验习惯，DMSO的体积还是一致的好。 5、检测MTT。 还原的MTT在460-630均有较好的吸收，如果你的酶标仪是滤光片，可以选470 nm左右或630 nm左右的滤光片，如果酶标仪有单波长，你可以在检测前扫描一下吸收谱，选用最大细说波长检测就是了，最大波长，大概在550nm附近，必要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收。 6、吸收值分析。 在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理组的吸收值应该在0.8-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。 7、如果你觉得MTT中出现的问题不好解决，那么建议你做CCK-8实验，原理与MTT相似，但操作上简化些，当然，费用也稍微高一些。 请问在做MTT实验室是否遇到过下面的情况：调零孔我用的培养基，在加MTT孵育4小时后，溶液颜色没有发生太大变化，为黄色，吸取溶液加入DMSO之后，溶液为粉红色，并不是无色，而且在490nm下的吸收值为0.2左右，我感觉挺大的，而加药组的最高浓度还不如调零孔的大，如果把调零孔的值减掉之后，OD值为负值。另外加药组加MTT4小时之后，溶液颜色有些发红。对照组测出的OD值在0.4～0.5之间。接种体积为100ul，5000cells/well，第一天接种，第二天加药，第三天测mtt，波长490nm。我做了很多次，每次的调零孔都那样，我想不是污染，而且也没污染的迹象。我怀疑时培养基的问题，而且我做过两次测试，一组只加含血清的培养基，一组为不加血清的培养基，其它孔接种细胞，细胞浓度分别为10000cells/well，5000cells/well，2500cells/well，这两次的结果：三个浓度下的OD值两次的都比较吻合，但加含血清培养基的和只加培养基的孔的OD值还是很高，应当还在0.2左右。不知是什么原因，请分析。另外，你所给出的值是不是在570nm下测的，我感觉在490nm下不会那么高吧，而且你复孔之间的差值一般是多少？ 不好意思，你说的现象我没出现过。还得注意几点： 1、MTT应该新鲜配制，在4度保存最多不能超过2周，也有说10天的，反正不能太久。 2、如果你养细胞的时间长，中途不换液，96孔板周边的孔是不能用的，应该加入无菌PBS。 3、如果有心，你可以在700 nm做一个参比吸收，将每个孔的检测吸收减掉参比吸收后再分析。 4、加入DMSO之前应尽可能将培养液弃除干净。 问：96孔板里的细胞长的好象没有在培养瓶里的好,有的时候都无法判断板里细胞的死活了.不知道有没有什么办法? 1、对于贴壁细胞：死细胞呈圆形，贴壁差；活细胞呈伸展状，贴壁好。 2、对于悬浮细胞似乎不好直接判断。有一个经典方法，就是用台盼蓝染色，细胞染上色的就是死细胞，然不上的就是活细胞，染色很快，一分钟内就可以判断，原因是活细胞的细胞膜完整，而且有什么外排机制，不易着色。如果96-孔板养不好，可以试着用24孔板。如果是旧板养不好，就试着用新板。为了将旧板洗干净，旧板可以下硫酸洗液2-3 h，但不要太长，否则板就黄了。还有一点，旧板的细胞培养时贴壁较差，可以铺多聚赖氨酸试试。如果你的细胞不好养，尽量不要用旧板。 问：加MTT孵育4小时后，溶液颜色没有发生太大变化，为黄色。我想请问一下，你的MTT是用无血清培养基配的吗？因为我有一次就是加错了，用正常的含血清培养基配了，结果颜色就不对了，干扰了MTT的检测。 MTT为淡黄色，用0.1 M的PBS配制，浓度为5mg/ml，配好后直接取20 ul加入到完全培养的细胞孔中（总体积在200 ul左右，MTT的体积占总体积10%）就行了。不要用培养基配制，更不要加血清，因为MTT的稳定性不太好，溶液越复杂，就可能导致MTT越不稳定。 问：我也做了很长时间的MTT实验，一直用的是570nm，和您说的波长所测值会有很大差异吗？ 如果酶标仪用的是滤光片，那就没啥选择性。570nm的吸收也是挺高的。波长不同吸光度会有差异，但不影响检测结果的趋势变化。如果你用的酶标仪有单波长（三棱镜或光栅衍射产生的），那么选用最大吸收波长有利于减少非特异性吸收所导致的误差。 问：我在的实验室做MTT实验所用的波长是双波，630和470 ，实验室的酶标仪没有570，不知单波和双波有何区别？ 单波长也是可以用的。双波长主要可以扣除非特异性吸收，比如细胞颗粒造成的吸收和板孔背景导致的非均一性吸收。如果使用96孔板前先检测板孔的背景吸收在0.05以下，或高于0.05的孔标记好不用，单波长也能大体扣除因此造成的非特异吸收。对于细胞造成的非特异吸收，细胞数越多，这方面的吸收也越高，对结果判断的方向性不会有太大影响。下图A是氧化型MTT的吸收曲线，B图是还原型的MTT吸收曲线，对于你的酶标仪建议使用470 nm。 |
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