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酶免疫电泳技术
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一、酶免疫电泳技术的原理 抗原与抗体在琼脂糖凝胶中电泳时，在碱性缓冲液的条件下，抗原带负电，向正极移动。不同分子量或还不同电荷的抗原，在相同条件下，移动距离不等。这些在不同部位的抗原，再与相关抗体经扩散形成免疫沉淀线。酶免疫电泳技术中的抗原与抗体就是酶和它的相应抗体球蛋白。酶抗原与酶抗体形成的免疫复合物是用底物显色的，由于酶反应的高度灵敏性，使酶免疫电泳技术成为一项灵敏度高的检测技术，但仅局限于酶蛋白的分析鉴定。 二、辣根过氧化物酶（HRP）免疫电泳技术的程序 1、 器材与设备 电泳仪（包括电泳槽）；温箱；载玻片（7.5cm×2.5cm）;小玻棒（长4cm左右，直径约1.5mm）；打孔器；铺有湿纱布的带盖搪瓷盒。 2、 材料与试剂 感染病毒的植物病叶，健株叶片作对照；辣根过氧化物酶（精制）制备的兔抗酶抗体；琼脂糖；0.1mol/pH8.6巴比妥钠盐酸缓冲液；底物与供氢体混合液（H2O2和DAB-4HC1）。 3、实验程序 （1）将小玻棒放在洁净的载玻片中央，然后将3ml溶化的琼脂糖溶液（0.8g琼脂糖/100ml巴比妥钠盐酸缓冲液）浇制其上，待冷凝后，用针尖挑去玻棒，中央出现一穴槽。 （2）在穴槽一端的两侧近边沿2mm处各打一小孔（直径2－3mm）,在一孔穴中加入健株叶片汁液，在另一孔穴加入感染病毒的植株叶片汁液。 （3）加汁液的孔穴一端接负极，电泳缓冲液仍是0.1mol/LpH8.6巴比妥钠盐酸缓冲液，电压150V，电泳1h。 （4）在穴槽加入抗HRP兔血清，置于湿盒中，在37℃温箱中反应3h左右或室温过夜。 （5）在生理盐水中浸洗3－4天，每天换水3次。 （6） 敷上干净的湿滤纸，置于40℃烘箱内烘干。 （7）浸入底物显色，从沉淀弧的形状，部位不同，比较健，病汁液所形成的沉淀线。 |
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