| 查看: 2054 | 回复: 5 | ||||
[交流]
PPO粗酶液的纯化 已有3人参与
|
|
一、原理 1.葡聚糖凝胶SephadexG-200凝胶柱层析利用大分子不能进入凝胶颗粒内部最先流出柱外，而小分子物质进入凝胶颗粒内部，流速慢而最后流出柱外，凝胶层析法能将不同分子大小的物质分离开。（G-200能分离800-80000D分子量的蛋白质） 2.利用离子交换法，选取DEAE-阴离子纤维素DE52柱材料，因为PPO是带有阳离子的蛋白质，在层析时会吸附在柱材料上，而杂蛋白会洗下。后用NaCl梯度洗脱PPO，（NaCl为强离子交换剂，能将弱吸附在柱材料上的PPO置换下来）。粗酶液从而得到纯化。 二、材料与试剂 试剂：0.02MTris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001MEDTA)配制时配×10倍浓缩液1000ml;NaCL;聚已二醇；DEAE-纤维素DE52；葡聚糖凝胶SephadexG-200;兰葡萄糖－40、70、100等； 实验器械与仪器设备：试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等；试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机 三、操作步骤 1．葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡 （1）柱材处理 称取一定量的SephadexG-200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。 （2）装柱 将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处，停止装柱，剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。 （3）平衡 在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.002MTris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001MEDTA)，平衡SephadexG-200凝胶。 2．上样：将粗酶液上柱。 3．洗脱：用0.02MTris-HCL缓冲液Ph7.4（内含0.001MEDTA）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。 4．DEAE－纤维素的处理及装柱 （1）处理 本实验采用的是DEAE－纤维素DE52是弱酸型阴离子交换剂，具体处理方法为：先将DE52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5N的HCL溶液中浸泡1－2h,再用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或PH4以上，并将其在抽滤漏斗中抽干；将抽干的离子交换剂浸泡在0.5N的NaOH溶液中1－2h，再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性。 （2）装柱 将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱材，轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降再层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.5－2cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出口连接蛋白质监测仪，待层析柱的平衡。 （3）平衡 在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中，用0.002MTris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001MEDTA)，预先将DE-52柱进行平衡。 5．上样： 将洗脱酶液上样，用0.02MTris-HCL缓冲液pH7.4（内含0.001MEDTA）洗脱杂蛋白。 6．洗脱： 用含NaCL(0.2-0.6M)的0.02MTris-HCL缓冲液pH7.4(内含0.001MEDTA)进行梯度洗脱。 7．测定酶活性和蛋白质浓度。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 有价值的生物经验贴 |
» 猜你喜欢
求助
已经有4人回复
-
0805材料320求调剂
已经有3人回复
-
297求调剂
已经有11人回复
-
268求调剂
已经有9人回复
-
一志愿西安交通大学材料工程专业 282分求调剂
已经有10人回复
-
278求调剂
已经有7人回复
-
26考研一志愿中国石油大学(华东)305分求调剂
已经有5人回复
-
280求调剂
已经有9人回复
-
279求调剂
已经有5人回复
-
286求调剂
已经有5人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
2楼2017-12-26 10:03:16
walking dead
金虫 (小有名气)
填料制备和蛋白纯化专家
- 应助: 40 (小学生)
- 贵宾: 0.001
- 金币: 1354.8
- 散金: 59
- 红花: 17
- 帖子: 287
- 在线: 56.5小时
- 虫号: 4175016
- 注册: 2015-10-26
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
3楼2017-12-28 13:20:20
4楼2018-01-12 10:39:41
walking dead
金虫 (小有名气)
填料制备和蛋白纯化专家
- 应助: 40 (小学生)
- 贵宾: 0.001
- 金币: 1354.8
- 散金: 59
- 红花: 17
- 帖子: 287
- 在线: 56.5小时
- 虫号: 4175016
- 注册: 2015-10-26
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
5楼2018-01-12 11:16:57
6楼2019-09-08 20:55:58
