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细胞凋亡检测之选择指南
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当细胞死亡时，研究人员往往会奋力排查死亡原因。他们采用各种分析，来确定细胞是经历了凋亡（apoptosis）、坏死（necrosis），还是程序性坏死（necroptosis），从而判断特定环境是否有毒，或者确定药物的作用机制。 凋亡是个复杂的过程，至少有两种主要途径 – 内在和外在 – 导致了程序性细胞死亡。它们汇集于caspase蛋白酶级联反应，最终破坏重要的细胞蛋白。确定哪条途径被触发，在哪个步骤被阻断，以及抑制剂是否能够抑制，催生了各式各样的凋亡检测。 它凋亡了吗？ 人们以不同的凋亡标志物为基础，开发了通用的凋亡检测，这些产品可单独或联合使用。形态变化，如细胞皱缩和细胞膜起泡，可在显微镜下观察。磷脂酰丝氨酸从内测翻转到细胞膜外侧，则可以通过Annexin V来检测。通过TUNEL检测来标记带切口的DNA，可观察染色体降解。caspase级联反应的激活则通过caspase及其产物的分析来实现。具体选择哪一种，这取决于多个因素，包括细胞类型和样品量、现有的设备和经验。 医生通常并不关心哪些途径或分子被触发或阻断，因为在开药之前，研究工作已经做了。而这些细节正是研究人员想要确定的。 Caspase检测 caspase作为酶原，始终存在于细胞中。一些酶，如执行者caspase 3和caspase 7，是组成型的二聚体，必须经过切割和重排，才能形成活性位点。另一些酶，如启动者caspase 8、9和10，是组成型单体，它们只有二聚化并招募到多蛋白复合物之后才激活1。 针对大多数感兴趣的caspase，市场上已经有了抗体。不过，由于caspase是组成型的，必须利用试剂来辨别活性和非活性形式，才能判断它们是否参与了凋亡。抗体这种关键的试剂可用于各种检测，包括流式分析、免疫组化、ELISA、Western blot和免疫荧光。 许多分析检测caspase酶的活性，而不是酶本身。“有一些底物被caspase酶普遍切割，如PARP和核纤层蛋白，而我们有特异针对那些切割产物的抗体，”Cell Signaling Technology（CST）的产品开发专员Gary Kasof说。其他底物只被单个或少数几个caspase切割。 当然，市场上也有并非基于抗体的检测。例如，许多厂商推出了广泛和特定的caspase试剂盒，基于FLICA（荧光标记的caspase抑制剂）检测，其中小小的荧光分子穿过活细胞膜，不可逆地与caspase活性位点结合，而未结合的试剂被洗掉。相同的概念已被用于PET探针，其中F-18 PET标记取代了荧光。 另一个选择是使用一种细胞系，它缺少了你感兴趣的特定caspase基因。“如果研究人员认为，他们已经开发出一种药物，触发了癌细胞的凋亡，那么，这是一种快速而简单的方法，来评估新药是否通过这个途径起作用，”Horizon Discovery的肿瘤项目经理Nicola McCarthy谈道，这家公司提供了一些单倍体caspase敲除产品。 除此之外 “我们也有其他的单倍体细胞系，它们缺失了凋亡途径的各种组分，”McCarthy补充道。 “如果你只是对下游的caspase家族成员感兴趣（这个家族至少有12种独特的caspase蛋白），你将看到几乎所有凋亡途径的融合，”Bio-Rad公司Bio-Plex产品的全球产品经理Daniel Braunschweig说。 不过，如果你只研究caspase，你也许会错过内在途径调控的凋亡。“癌症中缺乏凋亡，而神经退行性疾病或心脏病的过度凋亡，往往是通过Bcl-2家族成员实现的。”基于这个原因，Braunschweig表示，Bio-Rad Bio-Plex（基于Luminex）凋亡产品的重点放在Bcl-2家族。他认为，单一的标志物往往不足以清楚认识凋亡背后的机制。 “每当你想确定一个治疗方案是否起作用，或者给疾病分期，你总是需要多个标志物，”BioVision的技术支持专家Sunetra Ray谈道。也许这解释了流式细胞仪为何在凋亡研究中广泛使用。 对于与凋亡内在和外在途径相互作用的其他分子和通路，人们最近也表现出浓厚的兴趣。这包括凋亡抑制剂（IAP）家族和SMAC（IAP的抑制剂），它们的小分子模拟物已被开发出，以促进癌症中的细胞凋亡。 了解凋亡，有许多方式，从通用的（它是否发生？）到特异的（针对caspase 9和Bax）。你需要仔细选择。它可是关乎细胞生死的问题。 |
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