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PCR常见问题汇总 1. 无扩增条带 （1）酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。 （2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。 （3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。 （4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。 （5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。 （6）引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。 （7）DNA凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。 2. PCR产物量过少 （1） 退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。 （2） DNA模板量太少。增加DNA模板量。 （3） PCR循环数不足。增加反应循环数。 （4） 引物量不足。增加体系中引物含量。 （5） 延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。 （6） 变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。 （7） DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净 a 3. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散 （1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。 （2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。 （3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。 （4）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。 （5）引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。 （6）循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。 （7）退火温度过低。 （8）电泳体系有问题： ①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大； ②凝胶没有凝固好； ③琼脂糖质量差。 （9）若为PCR试剂盒则可能： ①由于运输储存不当引起试剂盒失效； ②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。 （10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。 4. 扩增产物出现多条带 （杂带） （1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。 （2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。 （3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。 （4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。 （5）样品处理不当。 （6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。 （7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。 （8） 复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。 （9） 反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。 （10） 引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。 （11） 引物量过多。减少反应体系中引物的用量。 （12） 模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。 （13） 外源DNA污染。确保操作的洁净。 5.阴性对照出现条带 试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。 6.条带大小与理论不符 1) 污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。 2) 模板或引物使用错误。更换引物和模板。 3) 基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。 文章来源：英格恩技术的官方博客 |
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