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基因克隆连接到T载体是不是多此一举？
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T载体是TA克隆载体的简称，就是利用载体的T末端和PCR产物的A末段连接而将目的基因克隆到载体中的方法。我们都知道，做基因克隆目的基因连接到载体，使目的基因能够在受体细胞进行稳定遗传。部分朋友是把目的片段先克隆到T载体后再酶切连接目的载体的，有部分朋友就直接将PCR产物酶切连接到能够将目的基因带入受体细胞进行稳定遗传的载体中。那么进行TA克隆到底是不是多此一举呢？相信有不少朋友都有过这种疑问。 不管你选择什么顺序的基因克隆，首先，要说一下必不可少的几个步骤：PCR、酶切、测序。 1.PCR 同一管PCR产物回收后，酶切连接做克隆，筛选出若干个PCR阳性的克隆(菌液PCR鉴定)送去测序。大多数的结果都是正确的，但是有时候出现送测序的几个克隆中有的就是有突变，反复测序都是这样。个人认为其原因在于PCR产物的异质性。也就是说，同一管PCR产物中有很多产物，有完全正确的(这部分可能占绝大多数)，有突变的全长，还有微量或者叫痕量的不完全产物。如果PCR产物直接测序，那么由于测序本身的原因，测序引物附近是无法准确读出来的，那么可能掩盖了实际存在的突变。如果就这样连接进去载体了，那么肯定是存在一定的错误的。 2.酶切 一般进行PCR 的模板采用菌液或基因组DNA。菌液还好，如果是基因组DNA，一般提取的基因组DNA量都不是很多，PCR的量也有限，然后进行酶切，而且酶切还存在着酶切效率的问题。假如一个3k的的片段，使用高保真酶25个循环好不容易或得了产物（不多）但如使用该产物进行2次PCR，可以说几乎所有的片段都存在突变。当然也可以先PCR 10个循环，再进行2次PCR，或许突变会少一点。但2次PCR的PCR条件还是要去摸索的。万一模板用完了，得不偿失。如果在第一获得了PCR产物的时候进行T连，T连成功后测序，如正确，再从质粒中进行PCR，突变的概率远远低于从低拷贝的模板（如cDNA）中进行PCR。无论从时间上还是金钱上使用T载体是合算的。 3. 测序 PCR产物酶切后连接进去做好克隆测序一次。如果是连接T载体测序，测序正确后酶切连接在进行一次测序，至少要车两次。测序一次大概至少需要4天时间，来来回回如果两次测序的话会耽搁很多时间，那就太耗费时间了。 如果是SNP，我认为完全可以用PCR测序，虽然可能出现我上面说的一些突变，但是SNP要以量取胜。也就是样本量N多的时候对最后的结果分析就没有多大影响了。 工欲善其事，必先利其器!磨刀不误砍柴工! 毕竟你不能保证无论多么难的片段，PCR－酶切－连接－测序都能一次成功。一般的克隆，PCR直接连就可以了。但也有的情况使用T载体可能更好，PCR产量低，模板珍贵，二次PCR突变较多等情况，可以使用T载体。毕竟T载体的连接效率相对较高。虽然后一种比较麻烦了一点，但是比较稳当一点。两种方法各有优缺点，大家根据自己的实验慎重选择！！！ 分享： 0 喜欢 |
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