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[交流]
甲醛变性电泳检测RNA完整性
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一、材料、试剂和仪器 1、材料：植物总RNA 5-10μg 2、试剂： 1）加样运载缓冲液（Loading buffer） 50% 甘油 1mmol/L EDTA （pH 8.0） 0.25%溴酚蓝 25%二甲苯氰FF 2）10×TAE Buffer 3）5×甲醛凝胶电泳缓冲液： 0.1mol/L MOPs （pH7.0） 40mmol/L乙酸钠 5mmol/L DETA（pH8.0） 4）甲醛，甲酰胺 3、仪器：电泳装置，紫外透射观测仪 二、实验程序 1、甲醛变性的琼脂糖（Agarose） 凝胶的配制 在250mL的锥形瓶中准确称量2g Agarose （Sigama），再加20mL 10×TAE Buffer，144mLDEPC处理过的双蒸水，微波炉中化胶，待冷却至50-60℃加EB至终浓度≤0.5μg/mL。在通风橱中加入36 mL甲醛，放置一段时间以减少甲醛蒸汽。 2、RNA的甲醛变性电泳 1） 样品制备 RNA总量10μg 5×甲醛凝胶电泳缓冲液4μl 甲醛 3.5μl 甲酰胺10μl 加入无菌离心管中混合，95℃水浴变性2min（或55℃，15min），取出后放入冰中冷却。 2） 加入2μl无菌的DEPC处理的加样运载液。（使用加样运载液的目的有三： 增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，便于加样操作；能明确显现样品在电泳胶上的泳动位置。以 0.5 X TBE作电泳液时，溴苯酚在琼脂糖中的泳动速率与长 300 bp 的双链线状DNA相同，而二甲苯氰FF 的泳动速率与长4kb 的双链线状DNA相同。） 3）将胶板浸没在1×甲醛凝胶电泳缓冲液中，点样前5V/cm预跑5min。点样后3-4V/cm电泳。 4）电泳结束后（溴苯酚蓝迁移到约8cm处），紫外灯下观察， 照相。 |
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