| 查看: 1235 | 回复: 1 | |||
[交流]
RNA的Nouthern印迹和狭线杂交分析实验 已有1人参与
|
|
Northern blot 是研究基因表达的最严谨的方法之一，可以定量分析组织中某一特异 mRNA 的表达丰度，根据其迁移位置也可以判断基因表达转录物的大小。该技术应用十分广泛，常用于分析 RNA 样品中特定 mRNA 的 大小和丰度，也可用于基因表达调控、基因结构及功能、遗传变异等研究。 实验材料 RNA 试剂、试剂盒 DEPC MOPS 甲醛 琼脂糖 乙酸铵 NaOH NaCl Tris·Cl 磷酸钠 溴化乙锭 SDS 仪器、耗材 离心机 电泳仪 培养箱 紫外线透照仪 杂交炉 实验步骤 1. 用72 ml 水溶解1 g 琼脂糖，在水浴中冷至60℃时，移至通风橱中加入10×MOPS电泳缓冲液和18 ml 12.3 mol/l 甲醛。 2. 铺制凝胶使之凝固，拔去梳子，将凝胶放进电泳池，加入足够的1×MOPS电泳缓冲液使能淹没凝胶面1 mm 左右。 3. 将每份样品的体积用水调整至11 μl，然后加入： （1）5 μl 10×MOPS电泳缓冲液 （2）9 μl 12.3 mol/l 甲醛 （3）25 μl 甲酰胺 （4）在漩涡混合器振荡混匀，并在微量离心机中短暂离心5~10 s 回收液滴，然后在55℃保温15 min。 4. 加入10 μl 醛加样缓冲液，在旋涡混合器中振荡，并在微量离心机中稍加离心以回收液滴。 5. 每分样品在一对加样孔中分别加入0.5~10 μg RNA样品，以便可取半片凝胶进行染色显。 6. 在5 V/cm 电压降下电泳至溴酚蓝染料泳动了凝胶长度的一半或三分之二。 7. 用溴化乙锭染色 （1）取出凝胶，切下需要染色的泳道。 （2）放置于无RNa酶的玻璃平血，加 入足够量的0.5 mol/l 乙酸铵覆盖，浸泡20 min 换液再泡20 min 以除去甲醛。 （3）倾去液体，加入含0.5 μl /ml 溴化乙锭的0.5 mol/l 乙酸铵，染色40 min。 （4）必要时以0.5 mol/l 乙酸铵脱色1 h。 8. 用吖啶橙染色 （1）取出凝胶，切下需要染色的泳道。 （2）在含10 μg/l 吖啶橙的1.1 mol/l 甲醛/10 mmo/l 磷酸钠中染色2 min。 （3）在不含吖啶橙的同样液体中脱色20 min。 9. 在紫外线透照仪中使凝胶中的RNA显迹，沿凝胶的边缘放一把尺子拍照，以便随后能确定膜中的条带。 10. 将非染色的部分凝胶放置于无RNA酶的玻璃平皿，加足够的去离子水浸洗几次以除去甲醛。 11. 凝胶浸泡在10倍体枳的0.05 mol/l NaOH/1.5 mol/l NaCl中30 min，使RNA部分水解。 12. 接着浸泡于10倍体积的0.5 mol/l Tris·Cl（pH7.4）/1.5 mol/l NaCl缓冲液中和30 min。 13. 将溶液换成10倍体枳的20×SDS，浸泡45 min。 14. 在玻璃或塑料平皿中放置一比凝胶略大的矩形海绵（必要时，可并排放两块或更多）加入足够的20×SDS以使海绵半淹没在液体中。 15. 构筑转移平台，剪3张与海绵同样大小的Whatman 3 MM 滤纸，放在海绵表面，并以20×SDS润湿。 16. 把凝胶置于滤纸表面，用玻璃吸管在其表面滚动挤压去除气泡，切4条塑料保鲜瞋覆盖在凝晈的边缘。 17. 剪一片与凝胶暴露面枳大小相当的尼龙膜或硝酸纤维素胶膜，在一个无RNA酶的玻璃平皿中加入约0.5 mm深的去离子水，将膜漂住水面使之润湿，直至膜沉没在水中。 18. 如果是尼龙膜，只需让膜在水中泡上5 min，如杲是硝酸纤维素膜，换成20×SDS再浸泡10 min。 19. 将润湿了的膜放在凝胶表面，排去气泡，以20×SDS洗膜表面。 20. 切5张与膜大小相 当的Whatman 3 MM 滤纸，放于膜的表面。 21. 然后将切得如膜大小相当的纸巾整齐地堆放在滤纸的表面，高约4 cm。 22. 在纸堆的顶部放一块玻璃平板，压一重物（0.2~0.4 kg），放置过夜。 23. 拆卸转移装置，回收膜和压扁了的凝胶，在膜上用铅笔标上加样孔的位置和方向。 24. 用2×SDS洗膜，然后放在一张Whatman 3 MM 滤纸上，让膜完全干燥 25. 硝酸纤维素膜的处理：将膜夹在两张Whatman 3 MM 滤纸中，80℃真空烤膜2 h。 26. 尼龙膜的处理：如上述方法烤膜或将干的膜包在能透过紫外线的塑料保鲜膜中，将有RNA的一面朝下，用紫外线透照仪照射合适的时间。 27. 如需要的话，凝胶可按步骤7或8操作，用溴化乙锭或吖啶橙染色以检查转印效率，或在含0.03%（w/v）亚甲蓝的0.3 mol/l pH5.2的乙酸钠缓冲液中染色45 s，在水中脱色2 min。 28. 制备放射比活在108 dpm 以上的寡核苷酸探针，并除去未标的寡核苷酸。 29. 用6×SSC液润湿携带RNA的膜。 30. 将膜带RNA的面朝上，放入杂交管中，毎10 cm2 面积加入1 ml 甲酰胺预杂交液/ 杂交液，杂交管在杂交炉中旋转保温3 h 温度设定在42℃（DNA探针）或60℃（RNA探针）。 31. 如果是双链探针的话，需在水浴或加热器中加热至100℃，保温10 min，移至冰上。 32. 吸所需要体积的探针加入杂交管中，在杂交炉中于42℃（DNA探针）或60℃（RNA探针）旋转过夜。 33. 倒出杂交液，按以下程序依次洗膜： （1）2×SSC/0.1%SDS室温旋转洗涤2次，每次5min。 （2）0.2×SSC/0.1%SDS室温旋转洗涤2次，每次5min（低严谨度洗涤）。 （3）于42℃预热0.2×SSC/0.1%SDS，在此温度下洗涤2次，每次15 min（中严谨度洗涤，可选）。 （4）于68℃预热0.1×SSC/0.1%SDS，在此温度下洗涤2次，每次15 min（高严谨度洗涤，可选）。 34. 在室温以2×SSC洗膜，吸干多余液体，盖上可透过紫外线的塑料保鲜膜，并进行放射自显影。 |
回复此楼» 猜你喜欢
一志愿北京化工大学材料与化工（085600）296求调剂
已经有3人回复
-
打过很多竞赛，085406控制工程300分，求调剂
已经有3人回复
-
北京林业大学硕导招生广告
已经有5人回复
-
一志愿北京化工大学材料与化工 264分各科过A区国家线
已经有4人回复
-
一志愿 西北大学 总分282 英语一62 求调剂
已经有4人回复
-
274求调剂
已经有15人回复
-
275求调剂
已经有6人回复
-
0856求调剂
已经有7人回复
-
材料调剂
已经有7人回复
-
化学工程085602 305分求调剂
已经有10人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
2楼2017-01-14 17:30:29
