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全血RNA快速提取 已有1人参与
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提示： （1） 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇！ （2） 使用前将10X红细胞裂解液RLB用DEPC处理水稀释到1X。 （3） 操作前在裂解液RLT中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml RLT 中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLT 4℃可放置一个月。 操作步骤： 1. 在适合大小的RNase free离心管中加入1体积（<1.5 ml）加入各种抗凝剂新鲜血液 (颠倒混匀后)和3体积的红细胞裂解液RLB，颠倒混匀，可轻弹管壁，确保混匀。 2. 室温放置10分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）。 如果RNA降解严重,可在冰上裂解,但是时间可长一些以充分裂解。 3. 12,000 rpm离心20秒，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团。 离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤2，3。 上清尽可能的吸弃，残留过多会稀释裂解液，造成裂解结合异常，产量纯度降低。 4. 涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬，加入350μl（<0.5 ml全血）或者600μl（0.5-1.5ml全血）裂解液RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒，充分裂解。病人血样中白细胞数量可能大幅增加，应该适当减少处理量。或者按照350μl（<2x106白细胞）或者600μl（2x106-1x107白细胞）比例加RTL。 5. 用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9mm针头) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。 6. 较精确估计裂解物体积，加入等体积的70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!），此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。 7. 立刻将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm离心60秒，弃掉废液。 8. 加700μl 去蛋白液RW1，室温放置30秒，12，000rpm 离心30秒，弃掉废液。 如果DNA残留明显，可在加入RW1后室温放置5分钟再离心。 9. 加入500μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RW，重复一遍。 10. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 11. 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-80℃水浴中加热效果更好）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。 12. 如果提取全血>0.5 ml或者>2x106白细胞,加30-50μl RNase free water重复步骤11，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。 洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。 |
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2楼2018-12-25 14:10:44
