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PCR-SSCP 技术实验
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实验原理 聚合酶链式反应-单链构象多态（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）技术是在PCR技术基础上发展起来的，它是一种简单、快速、经济的用来显示在PCR反应产物中单碱基突变（点突变）的手段。该方法已被用做癌基因和抑癌基因突变的筛查检测，遗传病的致病基因分析和基因诊断，基因制图等领域。 在SSCP测定中，双链DNA（dsDNA）被变性成为单链DNA（ssDNA），每一条单链DNA都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象，即使同样长度的DNA单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA在非变性条件下，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，单链DNA的迁移率和带型，都取决于其折叠构象和电泳时的温度。 试剂与材料 1．样本DNA（100 ng/ml）、MTHFR上下游引物（5 pmol/ml）、Taq DNA聚合酶（5 U/ml）、10×PCR反应缓冲液、4×dNTPs（2.5 mmol/L）、30%丙烯酰胺（交联度49:1）、5×TBE缓冲液、10%过硫酸铵（现用现配）、TEMED、甲酰胺上样缓冲液、固定液、银染液、显色液。 2．微量加样器、PCR自动热循环仪、聚丙烯酰胺凝胶电泳装置。 实验步骤 一、PCR反应 20 ml反应体系成分如下： 模板DNA（100 ng/ml） 1 ml 10×PCR反应缓冲液 2 ml Taq DNA聚合酶（5 U/ml） 0.2 ml 4×dNTPs（2.5 mmol/L） 1 ml MTHFR上下游引物 各 1 ml ddH2O 加至终体积 20 ml PCR反应循环参数： 95℃ 5 min； 94℃ 30 s、62℃ 50 s、72℃ 90 s，共30个循环； 72℃ 7 min。 反应结束后，置4℃保存。 二、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1．制备6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶：30%聚丙烯酰胺（交联度49:1）10 ml，5×TBE缓冲液10 ml，加蒸馏水至50 ml，加TEMED 25 ml、10%过硫酸铵250 ml，混匀后灌胶，插入加样梳子。待胶完全聚合后，拔出加样梳子，安装电泳装置，加入电泳缓冲液（1×TBE），缓冲液应高于加样孔上缘，用注射器吸取缓冲液冲净加样孔。 2．取5 ml 扩增产物加10 ml变性上样缓冲液混匀，98℃变性10 min，迅速冰浴。 3．取5 ml混合液加到点样孔中，以1～8 V/cm电泳4～5 h。 三、聚丙烯酰胺凝胶染色 1．拆下电泳装置，取出聚丙烯酰胺凝胶，放到一个塑料盘内，用蒸馏水冲洗1～2遍。 2．倒入固定液，固定8～10 min。 3．用蒸馏水冲洗1～2遍；倒入银染液，银染10～12 min。 4．用蒸馏水冲洗若干遍；倒入显色液，显色至出现清晰的银染带。 5．用蒸馏水浸泡聚丙烯酰胺凝胶，观察PCR-SSCP结果。 结果判断 观察并记录聚丙烯酰胺凝胶上的DNA单链带，根据异常泳动变位筛查突变样本。 应用 在遗传学方面的有广泛的应用，例如，癌基因或抑癌基因的基因突变的筛查，遗传病的致病基因的突变筛查和基因诊断等。 注意事项 1．靶DNA序列长度不宜过长，否则灵敏度下降。 2．DNA样品在电场中泳动的长度一般要求在16～18 cm以上。 3．染色最好在塑料盘中进行。 |
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