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zw0123456789zw至尊木虫 (职业作家)
Felix Baumgartner Space Jump
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细胞凋亡机制的发现 已有2人参与
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1995年王晓东(第一位美国科学院华裔院士) 完成博士后训练，组建了自己的实验室。他显然已经决定将寻找凋亡通路中的蛋白定为实验室未来的研究方向。顺着以前的研究而上，他首先想鉴定直接剪切caspase 3的蛋白酶究竟是什么。当仓鼠肝细胞组织匀浆液与caspase 3温育后，caspase 3被其中的蛋白酶剪切成两个片断。追踪这个活性，他实验室纯化得到了这个蛋白，测序结果显示它也是一个ICE蛋白酶的成员，与人的caspase 2高度同源7。仍然是“体外assay跟踪纯化进程”这一套，王已经掌握程咬金的“三板斧”了。 王晓东意识到caspase 3的剪切是凋亡的一个简单的检测指标，通过它建立体外assay，跟踪活性，可能可以找出细胞凋亡的通路。首先他想找到在体外能刺激启动凋亡的小分子。他把手头有的激酶、去磷酸酶抑制剂、核苷酸等，加入到未启动凋亡的Hela细胞质裂解液中。非常幸运地，他筛选到ATP或dATP能够激活细胞裂解液的凋亡反应：1、caspase 3 被剪切激活，2、下游分子PARP和SREBP能被激活的caspase 3剪切，3，当用激活的细胞质裂解液与仓鼠肝细胞的细胞核温育，细胞核的DNA被分解成核小体片断大小的DNA，这是细胞凋亡的经典指标。 借助于caspase 3被剪切和细胞核DNA分解这两个assay，王对细胞质裂解液进行分级纯化，跟踪引起凋亡的活性组分。当他们过第一个纯化柱后，发现结合在柱子上的蛋白和通过柱子的蛋白只有重新混和在一起后，才能对dATP有凋亡反应。这表明两个组分可能分别代表一个凋亡反应蛋白。通过固定一个组分跟踪另一个组分的方法，王和他的第一个学生刘雪松展开了竞赛：看谁先纯化到其中的一个蛋白。但是老**被新兵打败了。刘雪松发现用50％（90％？）硫酸铵沉淀组分后，活性成分仍然处在上清中，而此时的上清其它蛋白已经很少了，很快地，刘雪松把组分纯化到了一条带。传奇有时候是由巧合加运气造就的。这条带在PAGE胶上竟然是紫色的。王对它的光谱进行分析，发现它的光谱与细胞色素C一样，而蛋白测序的结果也确证了这个结论。王对于花这么大功夫纯化到在公司可以轻易买到的蛋白感到万分沮丧，而细胞色素C是线粒体电子传递链中的组分，它本不应该分布在细胞质裂解液中，另外对于线粒体在凋亡中有什么作用，王是没有一点头绪。 慢着！前面提到的抑制凋亡的bcl-2蛋白就是分布在线粒体外膜上的。当用细胞色素C的抗体特异地除掉细胞色素c后，细胞质裂解液也不对dATP反应。进一步地，王证明是因为破碎细胞的时候过于粗暴，线粒体在制备细胞质裂解液中被破坏了，如果加入蔗糖保护线粒体，裂解液将不再对dATP起凋亡反应（错误造就了发现！）。最后，如果用凋亡分子刺激细胞，王发现细胞色素c的确从线粒体释放到细胞质中。这些实验无可辩驳地证明了线粒体参与了凋亡的反应6。 王晓东纯化的那个组分在过另外一个纯化柱后又分成了两个必需组分，顺理成章地，这两个组分最后被纯化并命名为Apaf-1和caspase 98,9。谜底揭开了：Apaf-1正是线虫ced-4在人中的同源蛋白，而这些结果进一步说明细胞色素c在凋亡中的作用无可置疑。王将研究的注意力集中在阐述这三个蛋白的相互关系上。 Apaf-1通过N端的CARD结构域与caspase 9相互结合，通过C端的WD结构域与细胞色素c相互结合，通过Walker’s结构域与ATP/dATP相互作用。因为与Apaf-1共沉淀的多为ADP而非ATP形式，加之不能水解的ATP类似物AMP-PNP或者ATP-γ-s不能导致caspase 3剪切，王当时推测ATP的水解是必需的。但是同期与其他科学家合作的发现让王重新审视了这一设想：通过比较Apaf-1和在果蝇中的同源蛋DARK的序列发现，原先被认为负责ATP/dATP降解的两个氨基酸在DARK中并不保守，这提示ATP/dATP的降解在凋亡反应中也许并不是必须的。进一步的实验结果验证后者才是正确的：与纯度更高的Apaf-1/caspase 9/cytochrome c复合体结合的主要形式是dATP而不是dADP；复合体在凋亡前后结合的dATP并没有被降解为dADP；ATP的另外一个非降解类似物ADPCP同ATP一样可以启动凋亡。 通过重组表达蛋白的体外重建系统，以及后来与其它实验室合作对复合体结构的研究结果，王的实验室清晰地描绘了这些蛋白在凋亡中相互作用的情景：细胞收到凋亡信号刺激后，细胞色素c从线粒体中释放到细胞质，它与Apaf-1作用增进了与ATP/dATP的结合，与ATP/dATP的结合使Apaf-1蛋白CARD结构域相互作用多聚化，形成的含有7轴对称的蛋白和核苷酸的复合体被命名为凋亡体。凋亡体中的Apaf-1结构发生改变，招募caspase 9并导致caspase 9被剪切成两段，从而被激活。激活了的caspase 9进一步地剪切caspase 38-12。 乘胜追击-凋亡体上游与下游执行蛋白的发现 顺流而下，capspase 3的激活导致了细胞核DNA被剪切成核小体DNA大小的片断，那么中间的执行者是什么蛋白呢？如果将激活的caspase 3加入Hela细胞裂解液并与仓鼠肝细胞核温育，细胞核内的DNA被剪切成片断。这说明裂解液中存在执行蛋白。通过以上的体外assay，跟踪裂解液纯化的过程，鉴定出两个异源二聚体蛋白：DFF45和DFF4013。DFF40是其中的活性蛋白，DFF45是DFF40的伴娘分子（chaperone），如果没有DFF45共表达帮助折叠，单独表达的DFF40没有剪切染色质DNA的活性。同时DFF45抑制DFF40的活性，DFF复合体本身没有活性，激活的caspase 3把DFF45剪切成片断后，DFF40才从复合体中释放出来行使功能13-16。 在纯化DFF的时候王发现了一个奇怪的现象：被激活的DFF与细胞核温育可以剪切染色质DNA，但是基本上不剪切裸露的DNA。这促使王考虑到可能在核内存在着另外的因子介导或者帮助DFF40切割染色质DNA。DFF40本身有剪切裸露DNA的微量活性，但是当加入细胞核裂解液后这种活性得到了提高。据此建立assay，对细胞核裂解液进行分级纯化，鉴定出这个蛋白是HMG-217。相似地，HMG-1和histone可能通过招募的方式也能提高DFF40切割裸露DNA的活性15。 DFF敲除的老鼠细胞仍然在调亡刺激后有残余的剪切染色质DNA的活性，表明除了DFF以外有其它因子负责剪切染色质DNA。当时其他科学家已经发现AIF能从线粒体中释放并能直接导致细胞核染色质的片断化。王想系统筛选出另外的从线粒体释放并直接导致细胞核染色质DNA片断化的因子。它将线粒体和细胞核温育，当加入刺激线粒体释放cytochrome c（认为此时其它因子也一起从线粒体释放）的因子后，细胞核染色质DNA发生片断化。据此建立assay，将处理后的线粒体上清蛋白进行分级纯化，鉴定出了endonuclease G蛋白。endonuclease G是线粒体特异的核酸酶，它单独就能够剪切细胞核染色质DNA和降解裸露的DNA。Edonuclease G 的发现进一步说明了线粒体能存在一种途径不依赖于caspase而导致调亡事件的发生18。 逆流而上，王想知道什么因子影响了线粒体cytochrome c的释放。早在发现cytochromec在凋亡的作用后，本能的反应也应该是另外一个分布在线粒体外膜的凋亡蛋白bcl2与cytochrome c有没有什么关系。王找到两个细胞株：bcl2低表达的HL-60 neo和bcl2高表达的Bcl-2。用调亡刺激物刺激后，前者启动了调亡，cytochrome c释放，而后者则启动调亡，也没有cytochrome c的释放。这个结果表明bcl2可能通过抑制cytochrome c 从线粒体的释放来抑制调亡的19。进一步地，王建立了以下assay鉴定刺激细胞色素c释放的因子：加活性形式的caspase 8到细胞质裂解液，与线粒体温育，cytochrome c释放。据此，对裂解液进行分级纯化，鉴定出蛋白tbid。Caspase 8剪切tbid，tbid的C端片断从细胞质中转位到线粒体，引起细胞色素c的释放。Bcl2可以与tBid结合并拮抗它诱导细胞色素c释放的功能20。 对实验现象的敏锐观察往往能有新的发现。王在实验中发现，在体内，2小时UV照射后的细胞分离出来的线粒体才能观察到细胞色素c的释放和Bak的寡聚化（Bak寡聚化后被认为在线粒体膜上形成了孔道供蛋白通过，Bak的寡聚化是调亡的另一个指标）。在体外，30分钟UV照射后的细胞分离出来的线粒体，在37度温育30分钟后即可以看到等量Bak寡聚化以及细胞色素c的释放。体内的细胞色素c的释放相比于体外至少被延迟了一个小时。这进一步肯定了体内存在抑制细胞色素c释放的因子。将UV照射1小时后分离的线粒体与未照射的细胞质裂解液混和，发现后者具有抑制细胞色素c释放的活力。跟踪这个活力对裂解液进行半纯化，用已知的Bcl-2家族蛋白的抗体发现活性成分包括Mcl-1和Bcl-XL。进一步的实验发现，UV照射导致Mcl-1蛋白合成的停顿以及Bcl-XL从细胞质中转位到线粒体。前者是后者的上游事件21。 Smac的发现是另外又一个小现象大发现的例子。在研究apoptosome过程中，王发现如果在制备细胞裂解液的溶液中加入去垢剂，caspase 3的被剪切活性会增加，而制备了裂解液后再加入等量去垢剂则不具有这种效应。很显然的一个推断是去垢剂增加了膜蛋白的溶解，即某种膜蛋白能提高这种活性。果然，细胞膜沉淀后用去垢剂重新溶解的样品具有提高这种活性的能力。依此建立assay，对细胞膜样品分级纯化，得到了Smac蛋白。通过生化实验以及与华人施一功实验室解晶体结构的合作研究，王得到了一系列重要发现。在调亡过程中，Smac从线粒体中释放出来，通过与IAP（caspase的一类抑制蛋白）相互作用，释放出与IAP结合的caspase，从而解除了IAP对caspase的抑制。在研究中，王偶然发现GST融合表达的Smac完全没有活性，这提示Smac的N端是极其重要的。SmacN端的四个氨基酸与它在果蝇中的同源蛋白非常保守。进一步分析发现，体外合成的这四个氨基酸就有拮抗IAP的功能。Smac发现之后，其它实验室发现了另外一个拮抗IAP的蛋白Omi/protein22-24。 值得一提的是，同时期的科学家的发现完善了调亡的线粒体途径。由于该领域激烈竞争，王对Smac以及之前的endonuclease G研究的结果都是和其它科学家的结果同时发表在一个期刊上。而更多的蛋白纯化鉴定出来之后发现别人已经对它有研究了。不过王的结果都是用体外重建的方式清晰阐明的，这些结果进一步梳理了调亡的线粒体途径。细胞凋亡中, 在Capase-3天冬氨酸的位置被剪切为两个片断。Caspase-3正常以酶原（32 kDa）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的caspase-3由两个大亚基（17 kDa）和两个小亚基（12 kDa）组成。 Profile of Xiaodong Wang a Chinese-born American biochemist best known for his work with cytochrome c http://www.pnas.org/content/103/1/7 |
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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| 文中关于细胞凋亡的发展机制，介绍的还是比较全面的，可以分享一下凋亡检测的一些具体方法，悬浮细胞：300g，4℃，离心5min，收集细胞。贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃，离心5min，收集细胞。胰酶消化时间不宜过长(见注意事项)，以防引起假阳性。用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在300g，4°C离心5min，收集1-5×105细胞。注意:在洗涤细胞时，尽量避免损伤细胞。加入100μl 1×Binding Buffer重悬细胞。加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI，轻轻混匀。 避光、室温反应10 min。加入400μl 1 x Binding Buffer，混匀，样品在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。 |
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