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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR没有条带
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flyazheng

铜虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-07-26 22:17:19
扩不出来一般大方向:模板、引物、体系。模板考虑浓度和纯度(和上样量有关)，引物考虑退火和特异性，体系就看说明书怎么要求。看了你的图，觉得应该是引物和模板问题，建议模板测一下浓度纯度，引物的话重新设计吧。如果觉得引物没问题你就加少一点模板，换另一种酶试试。另外，阳性是指一定能扩出来的对照，阴性一般模板是水，但是也不一定，你可以拿别人的dna试着跑一下做对照。总之就是一步步实验排除各种因素吧。

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11楼2016-07-26 19:23:11
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23柚子茶23

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by flyazheng at 2016-07-26 19:23:11
扩不出来一般大方向:模板、引物、体系。模板考虑浓度和纯度(和上样量有关)，引物考虑退火和特异性，体系就看说明书怎么要求。看了你的图，觉得应该是引物和模板问题，建议模板测一下浓度纯度，引物的话重新设计吧。 ...

谢啦！

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12楼2016-07-26 20:41:29
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23柚子茶23

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 阿尔卑斯英 at 2016-07-26 15:22:13
对照Marker多大，怎么看都像是提取的RNA还带着基因组污染。

1kb的maker,最大的是15000

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13楼2016-07-26 20:43:32
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23柚子茶23

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by hbtmsw at 2016-07-26 09:56:47
要么是引物加多了 ,要么是模板太多或是杂质太多,前面一大片亮的要么是引物二聚体,要么就是模板中美除去的RNA,改进措施是降低引物浓度和模板添加量,提取的基因组最好是用RNA酶处理一下.

这是提取的基因组电泳图，不是PCR图

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14楼2016-07-26 20:44:56
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hbtmsw

木虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 23柚子茶23 at 2016-07-26 20:44:56
这是提取的基因组电泳图，不是PCR图
...

.....基因组,完全没看到,你提的怎么样品? 丝状真菌\酵母\细菌?    基因组提取 就算DNA断裂也会在几十KB的地方有条带,看你的胶marker如果是拉姆大Hind3的话那最后后面浅浅的一条可能是基因组条带,不管怎么样你的提取物RNA\蛋白都出去的不彻底,蛋白去除可用酚\氯仿重复抽提几次或是蛋白酶K处理,RNA加RNA酶处理.
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15楼2016-07-27 11:35:20
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23柚子茶23

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by hbtmsw at 2016-07-27 11:35:20
.....基因组,完全没看到,你提的怎么样品? 丝状真菌\酵母\细菌?    基因组提取 就算DNA断裂也会在几十KB的地方有条带,看你的胶marker如果是拉姆大Hind3的话那最后后面浅浅的一条可能是基因组条带,不管怎么样你的提取 ...

是放线菌的，提基因组有没有什么建议

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16楼2016-07-27 12:52:47
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hbtmsw

木虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 23柚子茶23 at 2016-07-27 12:52:47
是放线菌的，提基因组有没有什么建议
...

放线菌和丝状真菌一样比较难提,破壁很重要,菌体量要多一些,因为都是菌丝看着很多其实相比细菌而言DNA少的很,溶菌酶处理时间可以长一些,酶处理前也可反复溶冻,有条件也可液氮研磨.后面的就和其他细菌提基因组基本一样了,除蛋白的话传统方法就是酚氯仿多抽提几次,要不就加蛋白酶k处理
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23柚子茶23
17楼2016-07-27 13:54:29
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23柚子茶23

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
17楼: Originally posted by hbtmsw at 2016-07-27 13:54:29
放线菌和丝状真菌一样比较难提,破壁很重要,菌体量要多一些,因为都是菌丝看着很多其实相比细菌而言DNA少的很,溶菌酶处理时间可以长一些,酶处理前也可反复溶冻,有条件也可液氮研磨.后面的就和其他细菌提基因组基本一 ...

谢谢

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18楼2016-07-28 14:32:07
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tjabhm


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19楼2016-08-01 09:44:38
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